[发明专利]一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法

权利要求书

1.一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

重组类人胶原蛋白基因序列的设计，具体是：以选取的类人胶原蛋白III的氨基酸序列为基础；根据大肠杆菌的偏好密码子设计出编码重组类人胶原蛋白的基因序列，并在该序列3’端引入组氨酸纯化标签；

将重组类人胶原蛋白片段与pET24a载体的酶切连接，得到酶切产物，其中：重组类人胶原蛋白的基因序列如SEQ ID No.1所示；

将酶切产物用琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带；

将目的条带切胶，进行纯化回收得到类人胶原蛋白片段；

将类人胶原蛋白片段测定含量，并将类人胶原蛋白片段与pET-24a载体进行连接得到PET24-类人胶原蛋白片段连接产物；

将PET24-类人胶原蛋白片段连接产物热转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)得到重组类人胶原蛋白工程菌。

2.根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，重组类人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，将重组类人胶原蛋白片段与pET24a载体酶切连接时的酶切反应体系如下：

含类人胶原蛋白片段的质粒或pET24a质粒：10μl；

10×Fastdigest buffer：10μl；

NdeI：5μl；

XhoI：5μl；

H₂O：70μl；

37℃，30min。

4.根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳得到目的条带。

5.根据权利要求1所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，将类人胶原蛋白片段与pET-24a载体进行连接，连接反应体系如下：

类人胶原蛋白片段：4μl；

pET-24a载体：1μl；

T4 DNALigase：1μl；

10×T4 DNALigase buffer：1μl；

水：3μl；

25℃，30min。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，还包括大肠杆菌的发酵培养、蛋白诱导表达及纯化，具体包括以下步骤：

大肠杆菌的发酵培养：将工程细胞株接种于含Kan的LB培养液的离心管中，培养过夜；将过夜培养的菌株接种于含Kan的LB培养液中，振摇至菌体OD600为0.2-0.5；

蛋白诱导表达：向剩余的培养物中加入IPTG，振摇3-5h，诱导蛋白表达；

蛋白纯化：将过夜培养的菌液接种于新鲜的含Kan的LB培养基中，35℃-40℃培养，振摇至菌体OD600为0.6-0.8；补加IPTG；35℃-40℃诱导表达3-5h；取出培养物，室温离心，弃上清；将菌体沉淀用Native Binding-Buffer重悬后，超声破碎，3℃-8℃条件下离心，取上清；将上清液加入至Binding-Buffer预平衡的Ni亲和层析柱中，静音混匀仪上旋转混匀；收集流穿液；用Native Wash Buffer洗脱，得到纯化的重组胶原蛋白。

7.根据权利要求6所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，大肠杆菌的发酵培养具体是：将工程细胞株接种于含50μg/ml Kan的3ml的LB培养液的离心管中，37℃，220rpm培养过夜；将过夜培养的菌株按1：100接种于50μg/ml Kan的10ml的LB培养液中，37℃，220rpm振摇至菌体OD600为0.4，振摇时间为1.8-2.5h。

8.根据权利要求7所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，蛋白诱导表达：向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5-0.8mmol/L，35℃-40℃及220rpm振摇3-6h，诱导蛋白表达；离心收集菌体，用3mlTris缓冲液重悬，超声破菌，收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE。

9.根据权利要求8所述的重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法，其特征在于，蛋白纯化：将过夜培养的菌液以1：100转接于新鲜的1L含50μg/ml Kan的LB培养基中，37℃大量培养，OD600为0.6-0.8，振摇时间为1.8-2.2h，补加IPTG至终浓度为1mM，37℃诱导表达4h；取出培养物，12000g室温离心2min，弃上清；根据镍离子亲和层析柱Ni-NTAAgarose将1L诱导表达的培养菌体沉淀用30ml的Native Binding-Buffer重悬后，超声破碎，4℃条件下取12000g离心20min，取上清；将上清液10mL加入至Binding-Buffer预平衡的Ni亲和层析柱中，静音混匀仪上旋转混匀15min；收集流穿液；用8mL的Native Wash Buffer以0.5ml/min流速冲洗；用20ml的Native Wash Buffer以1ml/min流速冲洗柱子；用2ml的NativeElution-Buffer、4ml的Native Elution-Buffer及8ml的Native Elution-Buffer以1ml/min流速洗脱目的蛋白，得到纯化的重组胶原蛋白。