[发明专利]一种检测肌苷酸的酶生物传感器、其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物传感器技术领域，公开了一种检测肌苷酸的自组装ZIF‑67@AgNPs‑鲁米诺双酶电化学发光传感器、其制备方法和应用，其线性检测范围为0.001~25 g/L，检出限为0.0013 g/L。将AgNPs固定在MOF材料ZIF‑67上，采用十二面体结构分散AgNPs粒子，防止纳米AgNPs粒子团聚，同时利用ZIF‑67超大的比表面积和生物相容性，固定化两种水解酶(5'‑核苷酸酶和黄嘌呤氧化酶)对IMP进行水解，通过两步酶解反应得到的H₂O₂显著放大了鲁米诺‑H₂O₂体系的ECL信号。本发明酶生物传感器简单、快速、准确，灵敏度高，为维护食品质量安全提供了一个有效的ECL检测平台。

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，尤其涉及一种检测肌苷酸的双酶生物传感器、其制备方法和应用，用于食品中肌苷酸（IMP）的检测。

背景技术

肌苷酸（IMP）是一种单核苷酸，是生物体内ATP的代谢中间体，肌苷酸及其盐类能够产生鲜味，是肉品中重要的风味物质之一，它还能够与谷氨酸钠协同作用，使鲜味成倍增加，是一种常用的调味剂，除此之外，肌苷酸也是国际公认的衡量肉类新鲜程度的重要指标，目前，定量检测肌苷酸的方法包括分光光度法、高效液相色谱法等，但这些方法存在着检测成本高、耗费时间长、操作复杂等问题，相较而言，电化学发光酶生物传感器具有较高的敏感性和选择性，能够有效地放大信号，且样品用量较少，响应迅速，操作简单，更加适用于食品中肌苷酸的检测。

由于贵金属纳米粒子对鲁米诺-H₂O₂发光系统具有良好的催化性能，因此被广泛用于构建电化学发光传感器，然而，纳米材料容易发生聚合，影响传感器的灵敏度和稳定性，本文将AgNPs固定在MOF材料ZIF-67上，采用十二面体结构分散AgNPs颗粒，防止聚合，金属有机框架(Metal organic frameworks, MOFs)是以无机金属为中心和有机配体自组装而成的各种高多孔材料，由于其丰富的孔隙率和较大的内外比表面积，在储气、催化、吸附和ECL检测等领域得到了广泛的应用，ZIF-67超级大的比表面积和生物相容性被用于固定两个水解酶(5'-核苷酸酶和黄嘌呤氧化酶)以水解IMP，过氧化氢通过两步酶法水解反应显著放大鲁米诺-H₂O₂系统的信号。

发明内容

为了克服现有检测肌苷酸的方法检测成本高、耗费时间长、操作复杂的问题，本发明的首要目的在于提供一种具有良好选择性、灵敏度高和稳定性强的检测肌苷酸的酶生物传感器。

本发明的另一目的在于提供上述酶生物传感器的制备方法，通过合适的纳米材料的载体材料和催化发光方法获得性能稳定的电化学发光酶生物传感器。

本发明的再一目的在于提供上述双酶传感器在肌苷酸定量检测中的应用。

本发明的上述目的通过以下技术方法实现：

第一方面，本发明的检测肌苷酸的双酶传感器，由参比电极、对电极及修饰电极组成，所述修饰电极通过工作电极表面固化对肌苷酸敏感的物质识别膜得到；其中：

所述物质识别膜由复合溶液a、双酶复合溶液b和10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液按照体积比为1:1:1组成；其中，所述复合溶液a由20 mg ZIF-67粉末，5 mg AgNPs粉，5 mg鲁米诺粉，9.5 ml超纯水组成，所述双酶复合溶液b由2 mg/mL的5'-核苷酸酶溶液和2 mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液按体积比1:1组成；

所述5'-核苷酸酶溶液由5'-核苷酸酶溶于pH 6.0、0.01M的PBS溶液得到，所述黄嘌呤氧化酶溶液由黄嘌呤氧化酶溶于pH 6.0、0.01M的PBS溶液得到。