[发明专利]谷氨酸棒杆菌meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了谷氨酸棒杆菌meso‑2,6‑二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过结合定点饱和突变、组合突变以及迭代饱和突变对CgDAPDH的蛋白质进行改造，克服了亲本酶因为氢原子转移距离较长而导致的催化活性低的局限，获得的突变体CgDAPDH^{BC621/D120S/W144S/I169P}比酶活和k_cat/K_m值分别为亲本酶的38和120倍。将CgDAPDH^{BC621/D120S/W144S/I169P}与PmL‑AAD、SambHmaS和PaMDH偶联后，以L‑酪氨酸为底物，D‑HPG产量达到6.33g/L，为D‑HPG的工业化生产提供了潜在的生产方法。

技术领域

本发明涉及谷氨酸棒杆菌meso-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)作为一种重要的手性化合物，被广泛应用于医药、食品和化工等领域。在医药领域被作为一种重要的医药中间体，主要被用于半合成β-内酰胺类抗生素，如青霉素类的羟氨苄青霉素(阿莫西林)，头孢菌素类的头孢羟氨苄(氨羟苄头孢菌素)、头孢拉丁和头孢哌酮等。由于该类抗生素抗菌谱广、副作用小、口服效果佳等优点，在临床上应用越来越广泛，目前国内年需求量过万吨。此外，D-HPG还被用于合成肽类激素和农药的侧链，它是合成肌肽、泛酸及辅酶A的重要前体物质。

D-HPG可以通过化学法以及酶法合成。化学法包括Bucherer-Bergs法、尿素法、乙醛酸法以及Strecker法。其中，国内大部分的生产企业基本采用乙醛酸工艺生产，即在酸性条件下利用乙醛酸、尿素和苯酚的缩合反应制备而成。这类方法不仅会在生产过程中产生具有毒性的氰化物，而且原料昂贵、产量低、反应时间长。因而学者们开始研究用酶法生产D-HPG。酶法生产主要分为两个部分。首先以DL-对羟基苯海因为底物，利用D-海因酶(EC3.5.2.2)先将底物水解为N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸，然后再用N-氨基甲酰基-酰胺水解酶(EC3.5.1.6)脱去氨甲酰基得到D-HPG。化学酶联用法是先利用化学法将苯酚、乙醛酸和尿素率先合成DL-对羟基苯海因，再利用D-海因酶将其不对称水解为中间体N-氨基甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸。在碱性条件下，剩余的L-对羟基苯乙内酰脲在原位定量消旋化，导致D，L-对羟基苯乙内酰脲总转化为对映体纯的N-氨基甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸。后者通过在酸性条件下使用亚硝酸钠的化学方法进一步转化为D-HPG。不幸的是，通过尿素，苯酚和乙醛酸缩合得到底物DL-HPH的低生产率极大地限制了其工业应用。

作为替代方案，目前有多种生产D-氨基酸的方法，例如包括外消旋体拆分，α-酮酸和D-氨基酸之间的氨基转移以及α-酮酸的不对称还原胺化。其中，α-酮酸的直接不对称还原胺化过程因其高特异性及高原子经济性为合成D-氨基酸提供了一种有前途的方法。近年来，关于α-酮酸的不对称还原胺化的研究主要集中在meso-二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH，EC1.4.1.16)上。作为一种NADPH依赖的氧化还原酶，DAPDH不仅对天然底物meso-二氨基庚二酸表现出高特异性，而且对其他芳香族D-氨基酸也表现出一点的催化活性。例如，来自谷氨酸棒杆菌的DAPDH突变体(CgDAPDH^BC621)可以从10mM对氯苯基丙酮酸中以99％的转化率和99％ee产生10mM D-对氯苯基丙氨酸。尽管如此，基于生物质材料的D-HPG合成方法仍然很少。

发明内容

本发明提供了一种可以高效制备D-HPG的CgDAPDH突变体及其改造方法，并利用该突变体蛋白催化D-对羟基苯乙醛酸制备D-HPG，以及进一步将得到的突变体与L-氨基酸脱氨酶、对羟基扁桃酸合成酶和(S)-对羟基扁桃酸脱氢酶偶联，以生物质材料L-酪氨酸制备D-HPG。

本发明提供了谷氨酸棒杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH突变体，是以氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的谷氨酸棒杆菌meso-二氨基庚二酸脱氢酶CgDAPDH为出发序列，对第120、144、169和223位氨基酸进行了突变。