[发明专利]一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法

说明书

本发明公开了一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法，包括如下步骤：(1)菌体培养与收集；(2)反复洗涤菌体；(3)溶菌酶处理芽孢杆箘细胞壁；(4)液氮速冻；(5)加入RNAiso Plus震荡后放入水浴锅中加热；(6)氯仿提纯两次，并采用异丙醇沉淀；(7)采用DEPC乙醇清洗沉淀后再用无水乙醇清洗。(8)采用核酸密度检测仪和琼脂糖凝胶检测所提RNA的浓度和质量。本发明有效的方法解决了常规提取方法提取芽孢杆箘存在的RNAA260/A280以及A260/A230比值偏低及无机盐污染的情况。同时很大程度上去除了rRNA和tRNA，完整的保留了mRNA，更有利于后续实验的进行。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法。

背景技术

细菌RNA的提取相对于真核生物来说，难度更大。芽孢杆箘属于革兰氏阳性菌，相对于革兰氏阴性菌，其细胞壁厚(约20-80nm,革兰氏阴性菌约8-20nm)层数多(约15-50层，革兰氏阴性菌约1-3层)，细胞壁中的肽聚糖含量高(占细胞干重的50％-80％，革兰氏阴性菌为10％-20％)，且交联更为致密(1)。相对于RNA提取，有效的细胞裂解是获得高质量及高产量RNA必要且至关重要的前提条件。目前，常用的细菌细胞壁破碎法有超声波法、酶解法、液氮研磨法等等(2，3)，但这些常规的这些方法很难有效的破碎芽孢杆箘的细胞壁。除此之外，细胞壁破碎后，芽孢杆箘的内含物很容易与RNA结合，形成多糖多和酚类难溶的物质，导致RNA分离困难(4，5)。

芽孢杆菌属内多数种都具有强大的蛋白质外泌系统，能向胞外分泌多种酶，分泌的酶量大、种类多，其中就包括了RNA酶，而其产生的内源性RNA酶也加大了RNA提取的难度(6)。相对真核细胞来说，细菌RNA的半衰期较短，5′没有帽子结构，3′没Poly(A)尾巴，本身就很容易降解(7)，也加大了芽孢杆箘RNA提取的难度，因此常规的试剂盒无法提取高质量的芽孢杆箘RNA。

一般从材料中提取出的RNA中，rRNA大约占80％，tRNA约占10％～15％，mRNA约占1％～5％。而对于许多后续的分子生物学实验，rRNA和tRNA通常是没有用处的(8)。因此，研究人员常采用一些方法如加热法来去除总RNA中的rRNA和tRNA，以便更加有效地用于后续实验(1)。

芽孢杆菌属内多数种都能向胞外分泌多种酶，尤其是胞外分泌的RNA酶很容易造成RNA降解。因此，针对该问题，采用2mL的0.1％DEPC灭菌水对收集的菌体进行反复清洗(不少于4次)，以去除芽孢杆箘分泌的胞外酶，降低后续提取过程中RNA的降解。

由于芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，其细胞壁厚而致密，因此常规的提取方法不能有效裂解细胞壁使内容物释放，从而导致所提取的RNA出现浓度偏低的情况。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，而提供了一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法。

为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种适于芽孢杆菌的高质量总RNA提取的方法，包括如下步骤：

(1)菌体培养与收集；

(2)反复洗涤菌体；

(3)溶菌酶处理芽孢杆箘细胞壁；

(4)液氮速冻；

(5)加入RNAiso Plus震荡15min后放入100℃水浴锅中加热15-25min；

(6)氯仿提纯两次，并用异丙醇沉淀；

(7)采用75％的DEPC乙醇清洗沉淀2次后再用无水乙醇清洗2次。

(8)采用核酸密度检测仪和1％的琼脂糖凝胶检测所提RNA的浓度和质量。