[发明专利]Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用

说明书

本发明公开了Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用。Htra2基因表达抑制剂用于预防氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋。本发明还提供了一种用于预防获得性感音神经性聋的CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向并敲除Htra2基因。本发明证实AAV‑CRISPR/Cas9‑Htra2基因编辑体系内耳显微注射可安全、有效预防氨基糖甙类抗生素所致耳毒性聋。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用。

背景技术

衰老、噪声、感染及耳毒性药物是引起人类后天获得性感音神经性聋的主要原因，但治疗手段十分有限。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)已被应用于多项临床实验，并已经获得批准应用于临床，对人体细胞生长、形态或分化无明显病理影响，能感染处于有丝分裂后期的细胞，具有安全性高、免疫原性弱、宿主范围广、物理性质稳定、表达时间长及稳定等优点。多项研究表明AAV是目前感音神经性耳聋基因治疗的首选载体。对于获得性非遗传性感音神经性聋，已有利用AAV作为载体导入外源性过表达基因或RNA干扰(RNAinterference，RNAi)体系进行治疗的研究报道。这类技术有其相应的优势和局限性。

AAV介导的过表达策略可能需要多次给药以维持治疗效果，诱发临床相关免疫反应，并有引起外源性基因异位过表达的风险。RNAi是一种常用的基因失活工具，它的主要缺陷在于会引起序列特异性的脱靶效应。这样的脱靶效应很难预测，因为siRNA能够影响与它部分互补的序列，像microRNA那样抑制基因的表达。

规律成簇间隔短回文重复序列及其相关系统(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas system)中的CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术，依靠简单的向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)实现靶DNA序列识别，可以通过对sgRNA进行简单修改完成不同基因的靶向编辑，该系统目前已成功应用于多种生物的基因组编辑，极大地促进了功能基因研究。CRISPR/Cas9系统已经应用于肿瘤及艾滋病的治疗研究，并取得了良好的实验结果。虽然CRISPR/Cas9技术已在遗传性聋基因治疗领域取得了令人瞩目的研究成果，但目前尚未有将该技术应用于防治获得性非遗传性感音神经性聋的研究。

在抑制基因表达效率方面，RNAi是在转录后水平降低基因表达，而CRISPR/Cas9则可以靶向DNA并改变或敲除基因表达。CRISPR/Cas9系统的靶向精确性更高，sgRNA靶向序列必须和基因组序列完全匹配，Cas9蛋白才会对DNA进行剪切。shRNA或sgRNA均可靶向互补序列，可能造成依赖序列的脱靶效应。但是，RNAi还表现出不依赖序列的脱靶活性。两者相比，由于CRISPR系统必须在转录起始位点附近才能发挥作用，其脱靶效率要远低于RNAi。

氨基糖甙类抗生素(Aminoglycosides，AGs)所致耳毒性聋是获得性非遗传性感音神经性聋的典型代表且有成熟的动物模型可用于研究。AGs由于其成本低、高效对抗革兰氏阴性细菌、耐药性低而广泛应用于临床，但是，AGs耳毒性会导致内耳感觉毛细胞的死亡，影响前庭觉和/或听觉。对于需要多疗程静脉用药的病人(例如，结核病和囊性纤维化病患者)来说，耳毒性的发病率更高，甚至超过50％。

Htra2基因所编码的Omi/HtrA2蛋白是一种具有凋亡调节功能的蛋白酶，具有促进细胞凋亡的作用。以往的研究表明Omi/HtrA2通过抑制XIAP的功能促进了caspase-3的活化，导致细胞凋亡的发生。目前尚未发现调控Htra2基因拮抗氨基糖甙类抗生素耳毒性的研究。

发明内容

本发明的目的是提供Htra2基因表达抑制剂在预防获得性感音神经性聋中的应用，Htra2基因表达抑制剂用于敲除或抑制Htra2基因表达。