[发明专利]稳定表达生物素连接酶Bir A的细胞株制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种稳定表达生物素连接酶Bir A的细胞株制备方法及其在重组蛋白体内定点生物素化中的应用。本发明提供了该细胞株的构建方法及其应用实例：将Bir A基因插入真核表达载体；转染宿主细胞得到稳定表达BirA的细胞系；构建带Avi‑蛋白纯化联合标签的重组蛋白表达载体；转染BirA细胞系用于生产体内定点生物素化蛋白。本发明的独特之处在于实现了BirA基因在真核哺乳动物细胞内表达和重组蛋白体内定点生物素化；选用HEK 293F为宿主细胞，便于在生产重组蛋白的同时进行细胞内的定点生物素化，提高了后续进行生物学功能检测的效率；提供了应用HEK 293F‑Bir A细胞株生产体内生物素化重组蛋白检测、鉴定的基本方法和技术途径。

技术领域

本发明涉及一种稳定表达Bir A细胞株的制备方法及其在重组蛋白生产体内生物素化中的应用。

背景技术

生物素－亲和素系统(Biotin-Avidin—System，BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使BAS免疫标记和有关示踪分析更加灵敏。它已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。通过体外化学法进行生物素化是目前最常用的方法之一。这种方法方便、快捷、生物素化标记效率高。缺点是在对蛋白类试剂生物素化的过程中，生物素化位点是随机标记的，某些位点的生物素化形成的空间位阻会对蛋白活性造成影响。如何解决这一缺陷是蛋白质生物学活性研究中待解决的问题之一。

生物素连接酶(Biotin Protein Ligase)用于催化生物素化反应，可将生物素连接到特定的氨基酸位点上。常见类型包括大肠杆菌中的Bir A。Bir A作为生物素--[乙酰辅酶a羧化酶]连接酶可以在ATP存在下，Bir A激活生物素形成Bir A-生物素-5'-腺苷酸(BirA-bio-5'-AMP)复合物，通过共价结合到蛋白质赖氨酸位点上。 Avi-Tag标签蛋白是一个15个氨基酸的短肽(GLNDIFEAQKIEWHE)，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化。这样，借助Avi-tag和生物素连接酶，无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi-tag位点有效且特异性地被生物素化，大大降低了因为生物素化而引起的空间位阻效应，以避免影响蛋白生物学功能活性。

生物素连接酶来源于细菌等低等生物，在高等哺乳动物细胞是没有这类酶的。本发明通过实现Bir A基因真核哺乳动物细胞内表达，在蛋白质生产过程中的体内定点生物素化，可以极大地提高后续进行蛋白质生物学功能检测的效率；同时体内定点生物素化在保持重组蛋白生物学功能活性上明显优于体外化学标记法。

发明内容

本发明提供一种具有功能活性的稳定表达Bir A细胞系及其制备方法和应用。

一方面，本发明提供了一种稳定表达具有功能活性的BirA的真核细胞系

生物素连接酶来源于细菌等低等生物，在高等哺乳动物细胞是没有这类酶的。因此，本发明将(1)Bir A 基因插入真核表达载体，导入到HEK 293F细胞中，经过加压筛选得到稳定表达Bir A的细胞系；(2)同时构建带有Avi-蛋白纯化标签的蛋白表达载体；(3)将步骤2构建的蛋白表达载体导入步骤1建立的Bir A 细胞系用于生产体内定点生物素化蛋白质。具体步骤如下：

将Bir A基因克隆到真核表达载体，该真核表达载体具有如下特点：

Bir A编码基因处于转录调控原件的控制之下，可以在哺乳动物细胞中表达；

该真核表达载体具备在真核细胞中驱动外源基因表达的所有转录、翻译所需要的调控原件，包括启动子 promoter、增强子enhancer、转录起始区、polyA加工和转录终止信号，以及核糖体结合区、翻译起始信号、翻译终止信号等。