[发明专利]细胞计数方法

说明书

本发明提供了细胞计数方法，所述细胞计数方法包括以下步骤：(A1)构建第一高斯滤波器G₁和第二高斯滤波器G₂，并对活细胞图像f进行处理，获得第一图像f_dg＝f*(G₁‑G₂)；*表示卷积运算，所述第一高斯滤波器用于保留活细胞图像中的低频信息，所述第二高斯滤波器用于滤除活细胞图像中噪声，第一高斯滤波器G₁的标准差σ₁大于第二高斯滤波器G₂的标准差σ₂；(A2)对第一图像f_dg进行自适应阈值处理，获得细胞区域；(A3)对所述细胞区域进行孔洞填充和面积约束，获得第二图像；(A4)对所述第二图像进行活细胞计数。本发明具有计数准确、效率高等优点。

技术领域

本发明涉及细胞增殖，特别涉及细胞计数方法。

背景技术

细胞增殖是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础，与疾病的产生与发展有着密切的联系。细胞在增殖过程中的行为特性是生物医学领域研究的热点，对其研究必须在活细胞水平上进行。体外培养的单层细胞，经常用于研究细胞的行为，通常在多个时间点进行细胞计数来评估它们对刺激的增殖和分化。

在以前，常借助于细胞计数器之类的工具对细胞制品进行计数，这涉及到用胰酶消化培养瓶底层培养物来解离出细胞，破坏了细胞正常的生理活性，无法对同一细胞制品进行多次测量以生成完整的细胞生长曲线。人工检查和计数非常耗时，并且高度依赖于操作员的专业技能。

随着细胞分析需求的增加，耗时耗力的手动分析逐渐被细胞自动计数方法所取代。在自动计数方法中，图像处理算法是用于细胞分析最强大和通用的方法之一。荧光显微镜是细胞生物学中主要成像工具，能提供具有分子特异性的高对比度图像，但通常是定性分析细胞制品，光毒性和光漂白限制了活细胞的荧光成像。此外，使用外源性标记剂，也会给细胞带来不可逆转的损害，影响细胞正常生理活性。

相差显微镜采用相位对比技术将光穿过细胞微弱的相位变化转变为振幅变化，在其自然状态观察活细胞，由于不会破坏细胞正常生理活性，对其采集的图像进行自动化分析在解决各种生物学问题方面具有重要意义。

在细胞图像自动化分析中，细胞分割是最为基础和重要的领域，也是细胞计数的前提。然而，由于成像机制，导致相差显微镜采集到的细胞图像存在亮度不均衡以及细胞与背景对比度较低的问题，极大地增加了分割难度。为了解决该技术问题，现有技术中以下解决方案：

1.Ronneberger等人在FCN的基础上提出了U-NET模型，将反卷积层和特征层进行拼接弥补了信息损失，但由于梯度消失的原因，导致构建的网络深度有限。

2.张文秀等人以U-NET网络为基础，引入残差块模型强化特征传播能力，并利用注意力机制加强细胞区域的权重，减缓亮度不一致。这些方法需要人工手动制作大量的训练集以及耗时的模型训练，可能不适合对细胞图像进行大规模快速分析。

3.Yin等人根据相差显微镜的成像原理，建立线性成像模型，利用稀疏约束正则化函数来对图像进行复原，降低亮度不均衡和低对比度的干扰，后续仅使用阈值处理即可实现高质量的分割，但在图像复原过程中会消耗大量计算资源。

4.Jaccard等人结合局部对比度阈值和光晕伪影校正的方法快速实现细胞分割，但该方法处理高密度细胞图像时存在严重的欠分割。

5.其它方法，如Flight、Vicar等人提出的方法，但分割的准确性均受亮度不均衡及低对比度的影响。

发明内容

为解决上述现有技术方案中的不足，本发明提供了一种细胞计数方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

细胞计数方法，所述细胞计数方法包括以下步骤：