[发明专利]一种模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法及其分离鉴定方法

说明书

本发明属于球虫耐药株诱导及获取技术领域，具体涉及一种与抗球虫药相关的模拟田间快速诱导耐药株试验及耐药株的分离鉴定方案。本发明所述模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，通过设计前后两批快速诱导耐药株试验，能够在7周之内快速筛选出多株稳定的耐药虫株，进而在较短的时间内获得足够数量的耐药虫株。该试验在保证原始虫株背景清晰的情况下，能够快速筛选球虫耐药株，具有较高的时效性，满足后续深入分析所需要的样品数量，并且该方案在前后两种药物耐药株筛选的试验上均验证了该方法的可靠性，具有耗时短、操作简单，成本低的优势，可广泛应用于鸡球虫耐药株的试验诱导、筛选及鉴定。

技术领域

本发明属于球虫耐药株诱导及获取技术领域，具体涉及一种与抗球虫药相关的模拟田间快速诱导耐药株试验及耐药株的分离鉴定方案。

背景技术

鸡球虫病是由艾美耳属球虫引起的一种常见的寄生虫病，该病危害极为严重，每年全球因球虫病的感染造成大约30亿美元的损失，是鸡病中引起经济损失最为严重的疾病之一。艾美耳属(Eimeria)球虫隶属顶复门，目前已报道1800余种，现已发现并公认能够引起感染的艾美耳球虫有7种，即柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫。球虫能够破坏鸡肠上皮细胞，在规模化养殖中，以死亡率高为特征的球虫病爆发不常见，临床多见鸡食欲不振、精神萎靡、生产性能下降等症状，感染时常表现两种或两种以上的混合感染。

现阶段，养殖业对鸡球虫病的防控多以药物防控为主、疫苗使用为辅。但是，随着药物的广泛使用，诸多耐药株相继报道。目前，球虫领域对耐药性问题的解析，多集中在研究各地区耐药株的流行情况以及利用比较转录组学研究敏感株与耐药株基因表达水平的差异，尚无分子机制层面的解析。

重测序技术为我们解析找到药物靶点提供了技术平台，但其前提则是获得足够数量的耐药株样本。目前，获得耐药株的策略主要包括实验室药物梯度诱导以及田间耐药株筛选，前者虽能够获得中间代次的样品，追溯实验进化的动态过程，但其耗时较长，过程繁琐且获得的样本数量较少；而后者虽然能够获得不同的样本，但筛选到样品则会因为区域差异、背景复杂等因素影响后续的分析。另外，针对一些抗球虫药产生耐药性突变频率低，耐药株不易获取等问题，亟待建立一种高效的耐药株诱导试验方案，以便解析相关抗性机制，指导后续养殖业用药。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，以解决现有技术中筛选的耐药株试验方案存在耗时长、地方株背景复杂等问题，以便快速有效地筛选到足够数量的背景清晰、抗性稳定的耐药虫株；

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种抗球虫药耐药株的分离鉴定方法。

为解决上述技术问题，本发明所述的一种模拟田间快速诱导抗球虫药耐药株的方法，包括如下步骤：

(1)在垫料上散养雏鸡，设置加药组和球虫接种组，所述接种组的雏鸡接种孢子化的艾美耳球虫卵囊，且试验期间不添加任何抗球虫药物的饲料，所述加药组的雏鸡饲喂的饲料中添加含有工作浓度的抗球虫药物；

(2)在所述接种组的雏鸡接种的球虫完成一个生活周期后，收集所述接种组垫料中的新鲜粪便，并抛洒至所述加药组雏鸡的垫料表面以保证所述加药组的雏鸡能够感染，此后每隔七天向所述加药组投放所述接种组的垫料上的新鲜粪便；

(3)在试验周期内，每天分别收集所述接种组以及加药组雏鸡的新鲜粪便进行卵囊计数，并绘制排卵囊曲线，观察所述加药组雏鸡出现排卵囊的高峰时间；能够发现加药组在5周左右出现排卵囊高峰；

(4)第一试验周期结束后，另外选取新的雏鸡进行二次试验，其中，第一试验组的雏鸡饲养在原加药组垫料上，第二试验组的雏鸡则饲养在无球虫的新鲜垫料上；两组雏鸡均用含有不低于工作浓度的抗球虫药物拌料饲喂，并定期采集第一试验组垫料中的新鲜粪便，抛洒在第二试验组的垫料表面，进行感染；