[发明专利]一种裸眼观测的多色荧光免疫层析试纸条的制备方法

说明书

一种裸眼观测的多色荧光免疫层析试纸条的制备方法，以“红、橙、黄、绿、蓝”五色量子点荧光作为背景信号，五色量子点分别与牛血清白蛋白偶联后，再分别与五种真菌毒素检测抗原混匀喷涂在试纸条检测区域；银纳米粒子分别与五种真菌毒素的单克隆抗体结合作为量子点激发光的内滤探针。当检测样品中某种真菌毒素含量大于等于国家限量标准时，对应的荧光信号打开，可裸眼直观判读五种真菌毒素是否符合国家标准。本发明制备的试纸条可用于同时快速检测粮油制品中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B₁等五种真菌毒素。

技术领域

本发明涉及快速检测技术领域，具体涉及一种基于裸眼观测的多色荧光信号打开型竞争免疫层析试纸条，即基于银纳米粒子对多色量子点激发光的内滤作用构建免疫层析试纸条，快速检测粮油制品中黄曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及伏马菌素B₁等五种真菌毒素。

背景技术

我国是粮食生产和消费大国，加强粮食的质量控制意义重大。农作物在种植、采收、加工、运输和储藏过程中，容易被真菌污染，在温湿度适宜的条件下，某些真菌的产毒菌株会产生一类小分子次级代谢产物，即真菌毒素，给人类和动物带来严重的健康风险。对食品中真菌毒素实施监管和制定限量标准是保证食品安全的重要措施。

我国食品安全国家标准（2017）对谷物中四种真菌毒素制定了限量要求：黄曲霉毒素B₁（aflatoxin B₁, AFB₁）5~20µg/kg、赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OTA）5µg/kg、玉米赤霉烯酮（zearalenone, ZEN）60µg/kg和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, DON）1000µg/kg。此外，由于伏马菌素（Fumonisin）的毒性及污染的严重性，2019年食品安全国家标准真菌毒素限量征求意见稿中增加了伏马菌素B₁，B₂和B₃总量的限量要求：玉米、玉米面（渣）和含有玉米原料的谷物制品限量分别为4000、2000和1000µg/kg。建立同时检测上述真菌毒素的高灵敏快速检测方法具有重要的现实意义。

免疫层析方法因具有操作简便、快速、抗基质干扰能力强等优点，是现场快速筛查的常用方法。免疫层析方法针对真菌毒素等小分子待检物的分析，通常为竞争反应模式。即检测线（T线）上固定的检测抗原与待检物共同竞争信号物质上标记的抗体，检测信号强度与待检物含量成反比关系。定性或半定量分析通常以T线上“信号消失”作为判读标准，当待检物数量较多时才能使信号物质上标记的抗体处于饱和状态而不被T线上的检测抗原“捕获”。因此，基于“信号消失”模式的免疫层析方法的定性或半定量分析灵敏度不高。构建基于“信号打开”模式的竞争免疫层析技术，即检测信号随着小分子待检物浓度增大从无到有，可显著提高方法学检测灵敏度。

近年来一些研究小组尝试了基于胶体金的荧光猝灭竞争免疫层析模式，在这种模式中，荧光材料作为背景信号固定在检测线（T线）上，或者喷涂在整个硝酸纤维素膜（NC膜）的检测区域。当样品溶液中无待检物时，金标抗体泳动至T线与检测抗原结合导致荧光猝灭；当样液中存在痕量待检物时，被T线捕获的金标抗体数量减少，导致T线荧光信号打开。该方法与传统的竞争免疫层析相比，荧光信号随着待检物浓度增大从无到有，可显著提高检测灵敏度。如Fu等建立了基于胶体金和荧光素间荧光共振能量转移（FRET）的“信号打开”型免疫层析方法，用于检测重金属铬离子和克伦特罗（瘦肉精），检测限较传统的“信号消失”模式降低了十倍以上。