[发明专利]一种裸眼观测的多色荧光免疫层析试纸条的制备方法

权利要求书

1.一种裸眼观测的多色荧光免疫层析试纸条的制备方法，其特征是包括如下步骤：

（1）银内滤探针制备：

在1000mL体系中调整柠檬酸钠浓度至5mM，单宁酸0.025mM，剧烈搅拌下加热至沸腾，加入10mL 25mM硝酸银，溶液变成亮黄色；移出200mL反应液，反应体系中再加入170mL水，温度设定90℃，加入5mL 25 mM柠檬酸钠，15mL 2.5mM单宁酸，10mL 25mM硝酸银，90℃，保持30分钟；重复移出加入操作步骤，监测每次移出液的紫外吸收光谱，直到获得最大吸收峰为450nm的银纳米粒子溶液；

取五份100mL粒子数约为10¹¹个/mL的银纳米粒子溶液，6500转离心15分钟，弃上清；沉淀分别重悬于100mL含抗AFB₁、抗OTA、抗ZEN、抗DON和抗FB₁的鼠单抗腹水的0.1M pH7.5的硼酸缓冲液；室温缓慢搅拌2h，6500转离心15分钟，弃上清；沉淀重悬于100mL含0.1%（w/v）牛血清白蛋白的硼酸缓冲液中，5分钟后，6500转离心15分钟，沉淀重悬于10mL储存液中，4℃保存备用；

CdSe/ZnS量子点与BSA偶联：

五种色彩CdSe/ZnS量子点（QD），分别为蓝色QD₅₀₀、绿色QD₅₃₀、黄色QD₅₇₀、橙色QD₆₀₀和红色QD₆₃₀，表面羧基化处理，经EDC活化后与BSA偶联；五种羧基化量子点调整浓度为1µM，分别取1mL，调整pH 至5.7，室温低速搅拌下，加入0.1mL新鲜配制的1mg/mL EDC水溶液，活化5分钟，随后加入0.1mL 1% BSA溶液，室温反应1h；再加入0.12mL新鲜配制的1mg/mL EDC溶液，5分钟后加入0.12mL 1% BSA溶液，室温反应1h；第三次加入0.15mL新鲜配制的1mg/mL EDC溶液，5分钟后加入0.15mL 1% BSA溶液，室温反应2h；1000转离心5分钟去除过度聚合物，4℃储存待用；

（3）免疫层析试纸条的组装：

免疫层析试纸条由滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸五部分交叠固定在粘性卡纸上；

最底层为粘性卡纸，其中间部位粘贴NC膜，NC膜预先在检测区喷涂五种检测抗原和五色BSA–QD混合物，在质控位置喷涂驴抗鼠IgG抗体和BSA–QD₆₃₀；NC膜左边的粘性卡纸上依次粘贴喷涂五种银内滤探针的结合垫、样本垫和滤纸，结合垫右侧边缘与NC膜左侧边缘层叠1至2 mm，样本垫层叠在结合垫上面，左侧错开1至2 mm粘贴在卡纸上，滤纸层叠在样本垫上，同样左侧错开1至2 mm粘贴在卡纸上；NC膜右边粘贴吸水纸，吸水纸左侧边缘与NC膜右侧边缘层叠1至2 mm，检测时待测样品溶液经滤纸、样本垫、结合垫，在吸水纸毛细作用下进入NC膜，自左向右流动；

将滤纸、样本垫、结合垫、NC膜和吸水纸五部分组合后，切割成宽度4mm每条，装入试纸条卡壳中，然后与干燥剂一起装入避光袋密封保存；试纸条卡壳内有试纸条固定卡槽，在试纸条的滤纸位置设置加样孔，在NC膜五条检测线区域设置检测观测口，质控线位置设置质控观测口；

样本垫用包含1%BSA、0.5%吐温20和0.05%叠氮钠的50 mM pH 7.5的磷酸盐缓冲盐水浸润处理，真空干燥；

结合垫承载五种检测探针，用包含0.2%吐温20和2%蔗糖的10mM pH 7.5的磷酸盐缓冲盐水浸润、干燥处理后，五种银内滤探针混合物以20µL/cm喷涂在结合垫上，置于37℃的真空干燥箱中干燥6 h；

NC膜上依次喷涂FB₁检测抗原与BSA–QD₅₀₀混合物、DON检测抗原与BSA–QD₅₃₀混合物、ZEN检测抗原与BSA–QD₅₇₀混合物、OTA检测抗原与BSA–QD₆₀₀混合物、AFB₁检测抗原与BSA–QD₆₃₀混合物及驴抗鼠二抗与BSA–QD₆₃₀混合物，形成五条T线及一条质控线；检测抗原为各真菌毒素与BSA偶联物，摩尔偶联比为15:1，喷涂浓度以BSA质量计算为1.5mg/mL；各色BSA–QD喷涂量以450nm LED灯下裸眼观测到明显条带为调整依据，当样品中真菌毒素的含量等于国家标准要求时，对应检测线上荧光信号打开至裸眼观测可见；喷涂后的NC膜置于37℃的真空干燥箱中干燥6 h。