[发明专利]一种离体肝肾灌注系统及肝细胞再生方法

说明书

本发明公开一种离体肝肾灌注系统及肝细胞再生方法；所述离体肝肾灌注系统，包括：第一蠕动泵，第二蠕动泵，肝脏培养室，肾脏培养室，分别连通所述肝脏培养室、肾脏培养室的第一导管、第二导管，与所述肝脏培养室连通的加入口，与所述肾脏培养室连通的输出口；所述第一蠕动泵的泵头夹住所述第一导管，所述第二蠕动泵的泵头夹住所述第二导管；所述肝脏培养室、肾脏培养室、第一导管、第二导管均充有肝细胞培养液。本发明通过将肝脏离体后放置于离体肝肾灌注系统中培养，保证氧气和养分的供应，模拟体内的肝细胞再生微环境，让人原代肝细胞或肝样细胞在离体的肝脏中获得扩增或者再生，从而实现获得大量、高分化的肝细胞，满足应用需求。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种离体肝肾灌注系统及肝细胞再生方法。

背景技术

人原代肝细胞是指从人肝组织取出后立即培养的肝细胞，可用于肝脏基础研究、药物开发、细胞移植、生物人工肝以及肝脏再生。然而，原代肝细胞来源困难，存在严重的伦理问题。肝细胞再生成为解决这一难题的重要途径。目前肝细胞再生的方法有两种，一是体外法，即在培养皿通过细胞因子(例如J Hepatol.2017Mar；66(3):494-503.)或者小分子化合物(例如Cell Res.2019Jan；29(1):8-22、又如Cell Stem Cell.2018Dec6；23(6):806-819.e4.)将干细胞分化成肝样细胞或者肝祖细胞；二是体内法，即将肝细胞或者干细胞移植到免疫缺陷的动物体内，实现细胞扩增或者再生(例如Hepatology.2012Sep；56(3):1044-52、又如Nat Biotechnol.2007August 25(8):903–910.)。体外法简单易行，但由于在培养皿中进行，细胞产量有限，且细胞分化相对较低。体内法能得到大量、高分化的肝细胞，但免疫缺陷的动物需要苛刻的饲养条件、极高技术操作要求以及较高的失败率，导致成本难以降低。

因此，现有技术存在缺陷，需要改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种离体肝肾灌注系统及肝细胞再生方法，以解决背景技术提出的问题。

本发明的技术方案如下：提供一种离体肝肾灌注系统，包括：第一蠕动泵，第二蠕动泵，肝脏培养室，肾脏培养室，分别连通所述肝脏培养室、肾脏培养室的第一导管、第二导管，与所述肝脏培养室连通的加入口，与所述肾脏培养室连通的输出口；所述第一蠕动泵的泵头夹住所述第一导管，所述第二蠕动泵的泵头夹住所述第二导管；所述肝脏培养室、肾脏培养室、第一导管、第二导管均充有肝细胞培养液；所述肝细胞培养液为：添加0.05vol％-0.15vol％的携氧载体的基础培养液，所述携氧载体，用于给培养的组织供氧。

所述第一蠕动泵和第二蠕动泵用于分别驱动第一导管和第二导管内的肝细胞培养液，从而可以对放置在肝脏培养室内的肝脏、放置在肾脏培养室内的肾脏进行灌注，也即利用正常的离体动物肾脏串联在灌注系统中，将肝脏代谢废物通过泌尿系统排出体外，为肝脏的生长提供良好的营养。

所述肝细胞培养液为添加0.05vol％-0.15vol％的携氧载体的基础培养液，解决了肝脏、肾脏对氧气的需求，携氧载体可将氧气运输至组织深处，避免缺氧导致离体的肝脏、肾脏损伤、坏死。

处于离体条件下的肝脏组织，由于没有血液免疫细胞的攻击，基本没有免疫排斥，为人肝细胞扩增或者再生提供更优的免疫环境。提供肝脏的实验动物不再需要进行免疫相关基因的基因编辑，也不要极高的饲养条件，可进一步降低成本，提高扩增和再生效率。

所述携氧载体，由以下体积比的物质组成，携氧纳米载体：普朗尼克F-68(10％)：甘油：水＝(3-4)：(0.7-1.3)：(0.1-0.3)：(4-6)，所述携氧纳米载体为全氟萘烷或者全氟三丙胺；其制备方法为：将携氧纳米载体、10vol％普朗尼克F-68、甘油、水混合后，在0℃-6℃的温度下，15000-45000rpm搅拌1min-25min，然后通氧气20s-30min，获得携氧载体。