[发明专利]一种神经干细胞特异性基因的递送载体及其应用

说明书

本发明提供一种神经干细胞特异性基因的递送载体及其应用，涉及分子药物学分子医学技术领域。该递送载体是在重组腺相关病毒9的基础上进行随机基因突变，并以神经干细胞球为模型进行多轮体外筛选得到的新型rAAV载体。该递送载体的衣壳蛋白的氨基酸序列如SED ID NO：1所示，其能够靶向高效递送转基因元件至神经干细胞，与转导神经系统常用的rAAV9载体相比，本发明的递送载体对神经干细胞的转导效率得到显著提高，可用于制备与神经系统相关疾病的药物。

技术领域

本发明涉及分子药物学分子医学技术领域，且特别涉及一种神经干细胞特异性基因的递送载体及其应用。

背景技术

神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)是一类具有自我更新以及能分化为不同神经细胞类型的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化为不同的功能细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。虽然在健康成人体内神经细胞新生的水平较低，但在中风、癫痫和亨廷顿病等疾病状态下，已经发现存在神经细胞新生的现象。该发现给出了通过诱导人的神经细胞新生，有望提供治疗干预可能性的提示。以此为基础来替代或者修复那些坏损的神经组织或器官，有望为目前尚无治疗方法的神经性疾病提供治疗手段。

高效、靶向性基因传递为研究神经干细胞的静息、增殖、自我更新和分化的调控机制提供了手段。巢蛋白(Nestin)是一种中间丝类型的蛋白，能够特异性的在神经干细胞(NSCs)表达，被视为NSCs的分子标记物。Nestin-CreERT2转基因小鼠在Nestin启动子的控制下表达Cre重组酶，已被用于体内追踪NSCs及其子代细胞。除了基础研究外，基因传递还可用于基因或细胞替代疗法，以治疗神经退行性疾病或损伤。例如，通过特定基因的表达或敲除来调节新神经元的产生。此外，神经干细胞的基因传递已被用于表达神经营养因子，以保护神经退行性疾病，并且在脆性X综合征小鼠模型中，证明可以恢复成年神经干细胞中脆性X智力低下蛋白的表达。

目前，已经发现有一些基因递送载体，可以将基因递送至NSCs。如复制缺陷型腺病毒载体，可以将转基因传递到发育中的10.5-14.5天小鼠胚胎的大脑祖细胞内，用于跟踪祖细胞的分化，但尚未证明可以将基因传递到成体NSCs内(Hashimoto M,Mikoshiba K.JNeurosci.2004；24(1):286-96)。将含有质粒的聚乙烯亚胺(PEI)复合物注射到小鼠侧脑室，也可以选择性地将转基因输送到脑室下区(SVZ)中的NSC，但递送效率极低(Falk等,ExpCell Res.2002；279(1):34-9)。此外，van Hooijdonk等使用水泡性口炎病毒G糖蛋白假型慢病毒载体，将基因靶向递送至小鼠海马齿状回颗粒下层的神经祖细胞和未成熟神经元(van Hooijdonk等，BMC Neurosci.2009 13；10:2)。尽管慢病毒载体优先转导神经祖细胞和未成熟神经元，但在给药1周后，只有11％的阳性细胞是NSCs(Nestin阳性)。向小鼠海马体注射逆转录病毒载体，发现可以靶向转导处于有丝分裂期的神经祖细胞和神经母细胞(Jessberger等，Nat Neurosci.2008；11(8):888-93)，但脑中的NSCs很少处于分裂期。慢病毒载体只能通过间接体内法进行基因治疗，操作非常繁琐。另外，临床研究还发现慢病毒载体的染色体随机插入模式具有致癌风险。

腺相关病毒(Adeno-associatedvirus，AAV)是属于细小病毒家族的一种非致病性、无包膜病毒。AAV包含一个4.7kb的单链DNA基因组，其中包含侧翼反向末端重复序列(ITRs)，它是基因组包装的复制和信号来源。在ITRs之间，基因rep的开放阅读框(ORF)编码四种非结构蛋白，它们负责辅助病毒存在时的病毒复制、rep和基因cap的ORF的转录调控、AAVS1位点的位点特异性整合和病毒粒子组装。cap-ORF编码三种结构蛋白(VP1、VP2和VP3)，它们组装形成由60个结构蛋白聚合而成的病毒衣壳。从cap-ORF翻译的氨基酸序列决定了AAV的基因传递特性，包括抗体结合、细胞表面受体结合、聚糖结合和内体逃逸。