[发明专利]基于超疏水微阵列芯片的类器官原位玻璃化冻存方法

说明书

本发明提供一种基于超疏水微阵列芯片的类器官原位玻璃化冻存方法，所述方法包括：制备超疏水微坑阵列芯片，将混有类器官的基质胶接种到所述超疏水微坑阵列芯片上每个微坑中；在所述基质胶凝固后，将类器官培养基加入到每个微坑中；和玻璃化冻存。本发明方法省去了复苏时需要将类器官重新培养再进行后续实验所需的步骤和时间，能够提高类器官的活性并减少操作过程中的损失。

技术领域

本发明涉及细胞学技术领域，特别涉及基于超疏水微阵列芯片的类器官原位玻璃化冻存方法。

背景技术

类器官属于三维(3D)细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性，在临床研究和基础研究中已经被广泛应用。但是类器官的长期保存依然是一个限制其发展的一个潜在问题。为了长时间保存细胞的活力和初始特性，最常用的方法是冷冻保存。为了冷冻保存各种类型的细胞，组织，胚胎和类器官，科学家们已经开发了许多慢速冷冻方法。到目前为止，大多数生物库的低温存储类器官都采用传统的慢速冷冻方法。常规慢冻方法是指将类器官在常规冻存管中进行慢冻。首先将类器官进行消化回收，离心去上清后用培养基进行重悬；再次离心去上清，加入冻存液(例如，70％培养基+20％胎牛血清+10％二甲基亚砜)。之后将冻存管转移到程序降温冻存盒，将冻存盒放置在-80℃冰箱中进行程序降温，最后转移至液氮中长期保存。常规慢冻使用低浓度的冷冻保护剂进行冻存，由于类器官是三维培养的结构，从而使得低浓度冻存液无法快速渗入类器官内部，在冻存和解冻时，内部细胞会产生冰晶最后导致细胞活性降低，影响后续实验。

类器官中细胞之间的强粘附力使低浓度冷冻保存剂(CPA)难以渗透到此类3D培养物的内部结构中，这可能导致在类器官内部的细胞由于无法充分接触CPA导致其死亡并在解冻时破坏类器官的结构。有研究证明将类器官切成小块，进行冻存有利于冷冻液的充分渗透，但这样也导致了更加繁琐的操作步骤以及破坏类器官结构等问题。

近年来，科学家对类器官的玻璃化冻存技术也进行了很多研究，并显示出广阔的应用前景。常规玻璃化冻存方法是指在常规冻存管中进行类器官玻璃化冻存。该方法首先要将类器官从基质胶中消化回收，离心重悬后用培养基清洗化胶试剂；在用玻璃化平衡液孵育细胞，再次离心，去除平衡液；加入冻存液后快速转移到冻存管中，短暂孵育，然后直接放入液氮中长期保存。此技术需要将类器官进行消化回收，并经过多次离心去上清步骤，类器官复苏过程中同样要进行多次的离心重悬，这些操作会不可避免的导致类器官数量上的损失，使得珍稀样本数量减少，无法进行后续的高通量药敏实验。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供基于超疏水微阵列芯片的类器官原位玻璃化冻存方法，所述方法包括：

步骤1：制备超疏水微坑阵列芯片，所述超疏水微坑阵列芯片包括微坑阵列和超疏水涂层池，所述微坑阵列的微坑直径在300-1500μm，微坑深度为小于500μm和微坑间距为1500-3000μm；和所述超疏水涂层池的深度为大于50μm，所述涂层池与所述微坑之间的微坑壁厚为50-300μm，所述微坑阵列的微坑之间形成超疏水层，所述超疏水层是指其表面与水或水溶液的接触角大于150°、滚动角小于10°的疏水层；

步骤2：将混有类器官的基质胶接种到所述超疏水微坑阵列芯片上每个微坑中；

步骤3：在所述基质胶凝固后，将类器官培养基加入到每个微坑中；

步骤4：玻璃化冻存时，先去除掉培养基，之后在基质胶顶部添加玻璃化平衡缓冲液，孵育10秒-30分钟，孵育后除去玻璃化平衡缓冲液，每个微坑中加入玻璃化冻存溶液，液体交换10秒-30分钟后，将所述超疏水微坑阵列芯片密封并直接储存在液氮中。

在一种实施方式中，在步骤3中，将所述类器官培养基使用自动点样仪在玻片上点样，形成与所述微孔对应的培养基液滴，使用微型对准仪将所述玻片与所述芯片对准，完成所述类器官培养基的加液。

在一种实施方式中，在步骤4中，通过滤纸去除掉所述类器官培养基和/或所述玻璃化平衡缓冲液。