[发明专利]不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法

说明书

本发明属于基因转录调控领域，具体涉及一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。该方法包括以下步骤：S1、构建带有rFC标签的目的转录因子表达质粒，进而向细胞中引入TF‑rFC融合蛋白表达，培养到所需时期后收集细胞，并用磁珠偶联细胞；S2、通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)‑MNase融合蛋白孵育过夜；S3、通过加入CaCl₂，活化MNase，终止反应并收集释放出核的TF‑染色质复合物，进行纯化；S4、将上述纯化后的DNA片段进行测序文库构建并进行高通量测序。本发明规避了传统用于富集TF在基因组上结合位点的方法中高质量特异性抗体的需要，且避免了由于抗体效率影响特异性结合位点的富集，进而可以使用少至5000个细胞在全基因组水平上捕获TF的结合位点。

技术领域

本发明属于基因转录调控领域，具体涉及一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。

技术背景

转录因子(Transcription Factors,TFs)能够以序列特异性方式结合DNA来控制染色质结构和基因转录，对发育、分化、肿瘤发生等生命过程和疾病过程中的细胞命运决定具有至关重要的作用。尽管众多科学家对理解TF如何控制基因表达有着浓厚兴趣，精准定位TF在全基因组上的结合位点仍然具有挑战性。因此全基因组TF结合数据对于了解它们如何参与基因转录调控至关重要。染色质免疫沉淀测序(Chromatin ImmunoprecipitationSequencing，ChIP-seq)被广泛用于分析TF的全基因组结合位点，通常情况下单个TF的ChIP-seq实验需要10⁶甚至更多的细胞，这样的细胞量对于在早期胚胎发育等稀有样品中研究TF的作用几乎是不可能实现的。另一方面TF的ChIP-seq实验需要高质量的特异性抗体，但是目前人和小鼠中的大部分TF都缺乏高质量的特异性抗体，而对于斑马鱼、爪蟾等非哺乳动物物种中，几乎所有的TF都缺乏高质量的特异性抗体。为了避免抗体的限制，可以通过在所研究的TF中添加标签并使用标签抗体来产生TF的全基因组结合数据；然而对于大量细胞的需求仍然是研究TF在早期胚胎发育等稀有样品中参与细胞命运决定的功能和机制的一个障碍。因此，为了揭示关键TF在重要生命活动过程中的作用机制，需要一种新的技术来检测TF在全基因组上的结合位点。

最近，CUTRUN(Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease)被认为是一种可用于检测TF在全基因组结合位点的替代技术。与ChIP-seq相比，CUTRUN所需的细胞要少，这使得其在早期胚胎发育等稀有样品中分析TF的结合位点成为可能。然而CUTRUN仍然依赖于高质量的特异性抗体，这限制了它应用与于抗体效率低的TF或非哺乳动物模式生物中。

发明内容

在本发明方法中，我们提出了一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法(Fc fragment of immunoglobulin G tagging followed by CUTRUN(FitCUTRUN))。FitCUTRUN通过pA(G)-MNase中的protein A(G)与rFc区(兔IgG的Fc肽段)的直接相互作用，将MNase核酸酶带入目标染色质区域剪切、释放目标TF在基因组结合位点片段，这使得在早期胚胎发育等稀有样品中检测TF在全基因组上的结合位点及研究TF的作用机制成为可能。

本发明的一个目的是提供一种可应用于细胞系中不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。

本发明的另一个目的是提供一种可应用于早期胚胎发育等稀有样品中不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法，从而研究关键TF对早期胚胎发育等重要生命活动过程中的调控机制。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种不依赖于特异性抗体的捕获转录因子在全基因组上结合位点的方法，该方法包括以下步骤：