[发明专利]不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法

权利要求书

1.一种不依赖于特异性抗体的捕获转录因子在全基因组上结合位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、构建带有rFc标签的ELF1 FitCUTRUN转录因子载体，电转进K562细胞系中，培养18-24h后，收集细胞，用洗涤缓冲液洗涤后重悬得到细胞悬液；将平衡好的Concanavalin A磁珠加入到细胞悬液中，孵育20-30min，得到磁珠偶联细胞；

S2、利用digitonin通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)-MNase融合蛋白，4-5摄氏度条件下轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，protein A(G)识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域；

S3、通过加入CaCl₂，活化MNase，使MNase在目的TF结合位点周围进行DNA双链切割，加入EDTA螯合钙离子终止反应并收集释放出核的TF-染色质复合物，去除RNA和蛋白质后，酚-氯仿-异戊醇抽提纯化DNA片段；

S4、将上述纯化后的DNA片段进行测序文库构建并进行高通量测序；

rFc标签的氨基酸序列为：

PSTCSKPMCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK。

2.一种不依赖于特异性抗体的捕获转录因子在全基因组上结合位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将构建带有rFc标签的NanogFitCUTRUN转录因子载体，通过体外转录试剂盒获得NanogFitCUTRUN-rFc的mRNA，在斑马鱼胚胎的一细胞时期将NanogFitCUTRUN-rFc的mRNA显微注射至胚胎中，培养至所需时期后收集细胞;将平衡好的Concanavalin A磁珠加入到细胞悬液中，孵育20-30min，得到磁珠偶联细胞；

S2、利用digitonin通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)-MNase融合蛋白，4-5摄氏度条件下轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，protein A(G)识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域；

S3、通过加入CaCl₂，活化MNase，使MNase在目的TF结合位点周围进行DNA双链切割，加入EDTA螯合钙离子终止反应并收集释放出核的TF-染色质复合物，去除RNA和蛋白质后，酚-氯仿-异戊醇抽提纯化DNA片段；

S4、将上述纯化后的DNA片段进行测序文库构建并进行高通量测序；

rFc标签的氨基酸序列为：

PSTCSKPMCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK。

3.根据权利要求1或2任一项所述的方法，其特征在于，步骤S2包括：

用抗体缓冲液重悬磁珠偶联细胞，冰上放置30分钟，用dig-washing buffer洗涤后，重悬，加入pA(G)-MNase融合蛋白，在4摄氏度条件下，轻摇孵育过夜，pA(G)-MNase入核后，pA(G)去识别并结合TF-rFC的rFC区域，同时将MNase核酸酶带入目标染色质邻近区域。