[发明专利]基于基因编辑技术的双信号输出检测转基因大豆的电化学传感器的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了基于基因编辑技术的双信号输出检测转基因大豆的电化学传感器的制备方法及其应用，特点是包括磁性材料Fe₃O₄@AuNPs合成的步骤；信号单元Fe₃O₄@AuNPsDNA‑Fc/[Ru(bpy)₂]²⁺合成的步骤；将Cas12a酶溶液和crRNA溶液混匀室温孵育后加t‑DNA溶液和结合缓冲液混匀，室温孵育后，加入信号单元溶液，待切割结束后，采用磁分离的方法吸取磁性材料部分，将磁性材料部分重新分散至20μL水中的步骤；最后将磁性材料部分滴于处理过的磁性玻碳电极表面，即得到电化学传感器，可采用快速扫描伏安技术和电化学发光方法检测转基因大豆，优点是高灵敏度、高选择性以及操作简单快速。

技术领域

本发明涉及一种转基因大豆的检测方法，尤其是涉及一种基于基因编辑技术的双信号输出检测转基因大豆的电化学传感器的制备方法及其应用。

背景技术

转基因技术作为一项新兴的生物技术，指利用基因工程将人们期望的目标基因加入其它生物的遗传物质中，从而改善生物原有的性状或赋予其新的优良性状。近年来转基因技术在农业领域的应用与发展十分迅猛，已成为世界各国农业科技竞争的焦点。目前转基因大豆作为全球重要的粮食作物，占全球转基因作物总种植面积的57%(5860万公顷）。同时转基因食品安全问题也备受关注，因此开发一种灵敏度高且简单易操作的检测方法是必要的。

CRISPR/Cas是一种广泛存在于细菌与古细菌中的，由RNA介导的、可遗传的适应性免疫系统。现被开发成为新型的基因编辑技术，已经成功应用于农业、医学、生物学等领域。CRISPR/Cas12a属于第二大类，第V型系统。Cas12a在crRNA引导下特异性结合靶标DNA后，非特异切割单链DNA的特性被激活，可被应用于开发传感检测系统。

电化学发光（ECL）作为一种高灵敏度的分析方法，已广泛应用于免疫分析、核酸杂交分析等生物分析领域。该方法同时结合了化学发光灵敏度高、线性范围宽和仪器简单的优点，以及电化学方法重现性好、易控制的优点。快速扫描伏安技术（FSCV）是一种亚秒分辨率的电化学方法。其检测灵敏度随扫速的增加而提高，适用于痕量分析物的检测。目前，国内外还没有基于CRISPR/Cas12系统的电化学生物传感器检测转基因大豆的相关报道，也没有ECL和FSCV双信号输出检测转基因产品的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高灵敏度、高选择性以及操作简单快速的基于基因编辑技术的双信号输出检测转基因大豆的电化学传感器的制备方法及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于基因编辑技术的双信号输出检测转基因大豆的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）磁性材料Fe₃O₄@AuNPs合成

（2）信号单元（Fe₃O₄@AuNPsDNA-Fc/[Ru(bpy)₂]²⁺）合成

将180~220 μL Fe₃O₄@AuNPs转移到培养瓶中后，加入15~20 μL 3~5 mmol/L钌配合物[Ru(bpy)₂]²⁺和150~200 μL 90~100 μg/mL DNA-Fc（二茂铁），并将pH值调整为7.5，在35℃下孵育4~6小时后，添加160~200 μL 2 wt%牛血清蛋白溶液以阻断非特异性结合位点，再用磁清洗的方法除去游离的DNA-Fc后重新分散到200 μL水中，即得信号单元Fe₃O₄@AuNPsDNA-Fc/[Ru(bpy)₂]²⁺；

（3）CRISPR/Cas12非特异性切割过程