[发明专利]一种耐碳青霉烯类抗生素病菌的探针化合物及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测耐碳青霉烯类抗生素病菌的探针化合物，以及快速、实时、单细菌水平的检测和成像方法。本发明的化合物探针基于碳青霉烯酶与其底物的特异性水解反应，生成具有共振拉曼活性的产物，以此构建具有off‑on响应型拉曼探针，实现对耐药菌中碳青霉烯酶表达的实时无损连续监测。该方法信背比高，特异性好，所需样品量少，无需样品前处理，在几分钟之内即可完成检测。

技术领域

本发明涉及化合物领域，具体地说，涉及一种耐碳青霉烯类抗生素病菌的探针化合物。

背景技术

自1929年弗莱明发现青霉素以来，抗生素拯救了无数的生命，已成为人类健康的卫士。但由于抗生素的大规模使用甚至滥用，加剧了细菌基因突变，导致出现大量耐药菌种。特别是近年来越来越多的超级细菌(superbug)被发现，对人类生命健康已造成极大危害。目前，耐药性的细菌感染每年造成全球70万人死亡，大多数发生在发展中国家，预计到2050年将达到1000万人。我国颁布了《2016－2020年遏制细菌耐药国家行动计划》，旨在遏制细菌耐药，维护人民群众健康。因此，发展快速的细菌耐药性检测方法对指导抗生素临床准确使用、减少抗生素滥用具有非常重要的价值。β-内酰胺类抗生素是目前临床抗感染治疗中应用最广的抗生素。β-内酰胺酶(β-lactamase)的产生是80％以上病原菌耐药的主要原因。β-内酰胺酶的数量已经超过200种，常参与细菌的多重耐药。当前，碳青霉烯类抗生素是广谱性最高、抗菌活性最强的β-内酰胺类抗生素，能够耐受绝大多数β-内酰胺酶的水解。在治疗严重细菌感染中，碳青霉烯类抗生素已成为最主要的抗菌药物之一，能够有效地抑制或杀灭不同种细菌。因此，碳青霉烯类抗生素已成为严重细菌感染的最后一道防线。由于表达碳青霉烯酶的编码基因位于染色体或质粒上，可在细菌之间水平转移，加速了耐药基因的播散和进化，加之碳青霉烯类抗生素的过度使用，导致耐药菌不断增加。尤其是临床分离的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素耐药率快速增高，给临床治疗和医院感染防控带来巨大的挑战。世界卫生组织已于2017年2月将耐碳青霉烯类抗生素的菌株列入抗生素耐药“重点病原体”清单。另外，部分表达碳青霉烯酶的菌株仅表现为对碳青霉烯类抗生素敏感性减低，最低抑菌浓度(minimum inhibitoryconcentration,MIC)达不到耐药水平，容易引起人们的忽视。早期发现碳青霉烯酶对及时阻断细菌耐药性传播具有十分重要的意义。针对碳青霉烯等β-内酰胺类抗生素耐药菌的检测方法主要有三种：表型法、基因法和酶水解法。表型法通常是检测细菌对β-内酰胺抗生素的敏感性。该方法需要将病原菌从复杂的临床环境中分离纯化出来，再经过细菌培养，根据待测菌的生长状态来判断其药敏性，整个过程耗时数天，且缺乏专一性和灵敏性，无法及时准确地为细菌感染性疾病提供抗生素选择的实验依据；基因法虽然能够快速准确地检测到细菌中是否含有耐药基因，但只能检测耐药机制已经阐明的位点，而无法检测未知机制的耐药基因。另外，该方法不能确定含有耐药基因的菌株是否处于耐药状态，也不能提供MIC值，无法指导临床用药剂量；酶水解法利用耐药病菌产生的β-内酰胺酶能够快速水解β-内酰胺抗生素这一特点，通过比较水解前后β-内酰胺酶的底物颜色即可检测耐药菌。但颜色变化比较缓慢、灵敏度低，且受样品自身颜色的干扰，这些原因极大地限制了其应用。可以看出，表型法、基因法和酶水解法依赖复杂的样品处理，无法对耐药细菌产生的相关活性物质进行原位检测。此外，这些方法只能获取群体细菌耐药性评价的总体行为，而无法反映同一批细菌中不同个体的耐药性差异。因此，在单个细菌层次对细菌耐药性特别是碳青霉烯类耐药进行精准、快速、实时检测有助于指导临床上及时准确地使用抗生素。单细菌成像技术对研究相关活性物质在细菌耐药性发生过程中的作用机制具有重要意义。近年来，荧光成像方法被用于在单细菌水平上监测耐药菌内β-内酰胺酶的变化。荧光的方法通常需要设计特异性荧光探针底物，通过与细菌内的β-内酰胺酶发生特异性水解反应，导致β-酰胺键的断裂，引起荧光信号变化，从而实现细菌内β-内酰胺酶的检测。然而，荧光信号在复杂的生理环境中容易发生自猝灭现象，且在激发光多次照射下极易发生光漂白，难以对细菌内β-内酰胺酶的表达进行连续长时间监测。发展新型单细菌成像方法对耐药性实时动态研究具有重要意义。拉曼光谱是一种无损原位分析分子结构信息的重要手段，被广泛应用于食品安全、医学诊断、文物鉴定、石油化工等领域。与经典的荧光分析方法相比，拉曼光谱没有光漂白现象，其信号产生不受复杂生理环境的影响，无需进行样品前处理，因此非常适于原位、动态、实时分析。鉴于此，我们致力于探索可用于β-内酰胺类(特别是碳青霉烯类)耐药菌检测的拉曼探针。拉曼光谱对于分子结构的变化非常敏感，每种分子都具有特定的光谱“指纹”。我们通过分析β-内酰胺酶与其底物抗生素的水解反应发现，β-酰胺键的断裂会引起抗生素的共轭结构发生显著变化，生成具有激发光共振特性的拉曼活性分子，从而显著增强其拉曼信号，利用增强的拉曼信号可对β-内酰胺酶进行原位无损成像。鉴于此，我们在前期研究中利用拉曼光谱检测了一系列β-内酰胺类抗生素及其水解产物，发现头孢硝噻吩的拉曼信号十分微弱，而其水解产物的拉曼信号则提高了2-3个数量级。受此启发，我们拟设计合成能特异性响应碳青霉烯酶耐药菌的共振拉曼探针。相较于已报道的单细菌成像探针，该共振拉曼探针有如下优点：(1)具有off-on开关特性，从而大大降低了背景信号的干扰；(2)无需样品前处理，可对耐药菌中碳青霉烯酶的表达进行实时、原位、动态、无损连续监测；(3)灵敏度高，所需样品量少(1μL)，在几分钟之内即可完成检测，大大缩短了获取耐药性结果的时间。