[发明专利]一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法

权利要求书

1.一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）培养菌种

将木霉属（Trichoderma）真菌接种于PDA培养基中，20～35℃条件下培养2～6天，得到菌种；

（2）扩大培养

将所述菌种接种于PDB液体培养基中，在转速150～250转/分钟、21～35℃条件下摇瓶培养2～6天；按1～10%体积重量比（V/W）接种到大米培养基中，培养7～15天，得到大米培养物；

（3）孢子收集

将大米培养物在-50～130℃干燥，然后使用收孢机或旋风分离器收取孢子；

（4）孢子除杂

按重量体积比1g ：0.5～5 mL，在孢子中加入除杂剂1号，在温度10～50℃、第一次回流提取30～600分钟，提取液回收用于下一批样品处理；固体部分按重量体积比1g ：0.5～5mL，加入除杂剂2号，第二次回流提取30～600分钟，提取液回收用于下一批样品处理；固体部分再按重量体积比1g ：0.5～5 mL，加入除杂剂3号，搅拌均匀，在温度20～90℃、超声提取20～400分钟，过滤或离心，弃去滤液或离心上清，得到除杂孢子；

所述除杂剂1号的配方：按体积比乙酸乙酯或三氯甲烷：石油醚为 0.1～3：3～0.1；

所述除杂剂2号配方：按体积比甲醇或乙醇：丙酮为 0.1～3：3～0.1；

所述除杂剂3号配方：按体积比水：二甲基亚砜为 1：0～0.1；

（5）制备色素粗提液

在除杂孢子中按重量体积比1g ：0.5～5 mL加入提取剂，搅拌或者超声提取2～10小时，过滤或离心，滤液或离心上清即为色素粗提液；

所述提取剂由按体积比甲酸：乙醇为1：0~1混合的混合液；

（6）浓缩干燥

将色素粗提液减压浓缩，减压干燥，即得到色素粗提物；

（7）精制色素沉淀物

采用去杂法进行精制：按重量体积比1g ：1～10 mL将色素粗提物溶解于提取剂中，加入1～20倍体积的除杂剂3号使色素沉淀，离心过滤出第一沉淀物；按重量体积比1g ：1～10mL将第一沉淀物用提取剂复溶，加入1～15倍体积的除杂剂2号使色素沉淀，离心过滤出第二沉淀物；按重量体积比1g ：1～10 mL将第二沉淀物用提取剂复溶，加入1～10倍体积的除杂剂1号使色素沉淀，离心去除上清，得到精制色素沉淀物；

所述提取剂由按体积比甲酸：乙醇为1：0~1混合的混合液；

所述除杂剂1号的配方、所述除杂剂2号的配方和所述除杂剂3号的配方同步骤（4）；

（8）干燥

将精制色素沉淀物在压力小于或等于-0.1MP、温度-50～120℃条件下干燥，得到色素精制品，即为墨绿色粉末状的天然绿色色素。

2.根据权利要求1所述的一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于：步骤（1）中，所述木霉属（Trichoderma）的真菌为哈茨木霉（T. harzianum）、绿色木霉 (T. viride)、康宁木霉（T. koningii）中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于：步骤（2）中，所述PDB培养基的配方：6g马铃薯干粉或20g去皮鲜马铃薯、20g葡萄糖、加水至1000mL；所述大米培养基为在水中浸泡10～100 mim、高压灭菌的大米。

4.根据权利要求1所述的一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于：步骤（4）中，所述过滤的滤膜为100～600目；离心条件为：离心转速5000～20000转/分钟、时间5～20分钟。

5.根据权利要求1所述的一种木霉属真菌中天然绿色色素的提取方法，其特征在于：步骤（5）中，所述过滤的滤膜为100～600目；离心条件为：离心转速5000～20000转/分钟、时间5～20分钟。