[发明专利]一种能够快速有效从含粉尘的细胞悬液中分离细胞的方法

说明书

本发明涉及一种能够快速有效从含粉尘的细胞悬液中分离细胞的方法，该方法包括以下步骤：步骤1：使用Ficoll淋巴细胞分离液分离多种经粉尘染毒的单个核细胞细胞悬液，步骤2：使用Percoll细胞分离液分离各种经粉尘染毒的细胞株；步骤3：对于单个核细胞悬液，将Ficoll分离液缓慢加入离心管中，再加入含粉尘的细胞悬液；步骤4：对于细胞株悬液，先加入70％比重的Percoll分离液，再加入50％比重的Percoll分离液，最后加入含有粉尘的细胞悬液；步骤5:将离心管1500r/min离心20分钟，取中间细胞层。这种方法经过验证，可以分离50μg/mL‑2000μg/mL浓度粉尘的细胞悬液，而且具有细胞损失少、回收细胞活力好的优点，便于进一步的细胞实验。

技术领域

本发明属于细胞生物学检测领域，具体是一种能够从含粉尘的细胞悬液中分离细胞的方法。

背景技术

工业生产中产生的石英粉尘和煤尘是我国最严重的职业有害因素之一，生产过程中若长期吸入大量石英粉尘可以引起矽肺，长期吸入煤尘可引起煤工尘肺。肺内沉着的粉尘可以引起肺组织的结构破坏、持续性炎症和肺部纤维化。实验室内对石英粉尘和煤尘进行相应的动物和细胞实验，用来模拟工人接触的石英粉尘和煤尘。

传统意义上的细胞分离术主要包括离心技术、流式细胞术和细胞电泳技术、杂交微流控技术等。离心技术主要依据的主要是依据细胞和细胞器的密度不同，来分离不同的物质；流式细胞术的分离方法主要依据细胞它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，能从复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离，单次可同时对其中一种到四种特定细胞进行超高速分选纯化、高通量单克隆分选或细胞芯片制备；细胞电泳技术是将细胞制备成悬液，在特定的电场作用下进行运动并获得细胞的一种分选方法；杂交微流控技术是在微纳米尺度空间中对流体进行操作的科学技术。在实验中最为常用且经济的方法为离心技术，而且对后续实验细胞的伤害比较小。

为了模拟粉尘对接触者的生物性损害，实验室常常需要对粉尘和煤尘进行动物实验，主要包括对小鼠进行肺内灌注，对细胞进行粉尘染毒。然而下一步的检测需要分离纯化细胞，由于粉尘颗粒细小，密度大，如果直接离心处理很难将细胞与粉尘颗粒彻底分离，影响后续的免疫荧光、流式细胞术等检测。

根据相关文献，尚未有明确的对含有粉尘的细胞悬液进行处理的方法，本发明通过使用特定的细胞分离液，通过不同的密度梯度离心，得到纯化的细胞，并且该方法具有细胞损失少、回收细胞活力好等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速有效从含粉尘的细胞悬液中分离细胞的方法，该方法能够解决背景技术中所提出的问题，并且该方法具有如下特点：1、使用两种不同密度的细胞分离液，包括密度在1.077±0.001g/mL的淋巴细胞分离液(Ficoll)和1.30g/mL细胞分离液(Percoll)；2、这种方法可以分离多种经粉尘染毒的细胞悬液，包括小鼠肺组织、脾脏组织、肺泡灌洗液等单个核细胞悬液，也可以分离各种经粉尘染毒的细胞株；3、这种方法经过验证，可以分离的粉尘类型包括直径小于0.05μm的煤尘、二氧化硅、以及不同浓度配比的二氧化硅和煤颗粒的混悬液，粉尘工作液浓度可以从50μg/mL-2000μg/mL；4、通过此方法分离的细胞损失少、回收细胞活力好，便于进行下次进一步的细胞实验。

本发明实现发明目的采用如下技术方案：

第一方面，使用淋巴细胞分离液(Ficoll)快速有效从含粉尘的细胞悬液中分离细胞的方法，包括以下步骤：

S1：将含有粉尘的组织用剪刀小心地剪碎，使用研磨法和消化酶消化法将组织处理成单细胞悬液，使用含10mg/L酚红的RPMI1640培养基进行混悬；

S2：在15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液(Ficoll)；

S3：然后将离心管倾斜，用毛细滴管将细胞悬液沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰；两者比例为1：1；