[发明专利]一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用

说明书

通本发明公开了一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用，通过对YML4‑3菌株叶酸合成DHPPP途径中folQ基因的敲除和回补，测定各菌株的生长曲线、pH、OD600和抑制病原菌能力等，确定folQ基因在叶酸合成中发挥重要作用，研究基因来源于食品级微生物，具有安全性，并且叶酸无论对微生物还是人体，都是其发育过程中比不可少的营养元素，适当的补充有助于健康发育，因此，探宄微生物中叶酸合成关键酶基因的功能与地位，有助于了解其产生叶酸的机理，进而提高叶酸产量，为后期开发叶酸发酵食品奠定基础。

技术领域

本发明属于叶酸合成技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用。

背景技术

叶酸，维生素B9，是一种水溶性B族维生素。是由喋呤、对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid,pABA)和一个或多个谷氨酸结合而成，是一种无色无味的黄色或橙黄的晶体或者晶状粉末，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，溶于氨水、氢氧化钾等碱性溶液，在酸性条件下极不稳定，在光照条件下，尤其是紫外线的照射下易被破坏,生物体普遍需要叶酸，然而不同的生物体获得该营养物的途径各不相同。动物本身不能够合成叶酸，然而能够通过摄入食物而获得。而植物和部分微生物能够完全生物合成叶酸，只是它们合成的方式存在差异。目前研究较多的是植物和乳酸菌的叶酸合成方式，因为果蔬和发酵食品中的叶酸是人体摄入该营养素的主要来源,人体不能够自身合成叶酸，只能从饮食中摄取，每个成人每日需摄取400μg叶酸才能满足自身生命活动所需，大量研究证明，叶酸摄入不足会引发很多疾病，它在快速的细胞分裂和生长过程(如婴儿发育、怀孕)中尤为重要，因此孕妇自怀孕前就必须摄入足够叶酸以保证胎儿神经系统的正常发育，此外，叶酸还可以提高精子质量，减少染色体缺陷从而降低新生儿唐氏综合征的发生几率。它还能够促进骨髓中的幼细胞发育成熟形成正常红细胞，叶酸缺乏会造成孕妇和婴儿贫血因此，每日补充叶酸则是非常重要。

在植物体中，叶酸作为一碳单位(one-carbon units)的供体和受体，参与C1转移反应，参与甲硫氨酸(methionine，Met)、丝氨酸(serine，Ser)和甘氨酸(glyc ine，Gly)的生物合成以及组氨酸(histidine,His)的分解代谢。此外，叶酸在甲基循环(methyl cycle)中也发挥核心作用，通过S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methio nine，SAM)来实现一系列的甲基化反应。叶酸也可以通过甲基循环为甜菜碱生成提供一碳基团，并且甘氨酸脱羧酶(glycine decarboxylase，GDC)和丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase，SHMT)(在光呼吸代谢中负责Gly和Ser相互转换的重要酶)均需要叶酸衍生物作辅酶来完成一碳基团的转移。近几年来，随着研究的不断深入，人们陆续又发现叶酸在植物体内尚具有调控基因表达、提供电子供体和作为天然色素等一些新功能。例如，最近的研究发现，叶酸能够与核糖体结合，达到类似于开关的效果以控制基因的表达，这为消除产叶酸病原微生物提供思路。因此，叶酸在植物体内具有不可忽视的作用，为以后揭示生命活动提供坚实的理论基础。

发明内容

本发明要解决的问题是通过对YML4-3菌株叶酸合成DHPPP途径中folQ基因的敲除和回补，测定各菌株的生长曲线、pH、OD600和抑制病原菌能力等，确定folQ基因在叶酸合成中发挥重要作用。

本发明采用如下技术方案实现发明目的：

一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用，所述应用主要通过以下步骤：

(1)使用同源重组的方法，定向敲除L.plantarumYML4-3菌株叶酸合成DHPPP途径中folQ基因，得到folQ基因敲除菌株△fol Q；

(2)仍使用同源重组方法将folQ基因回补至△folQ菌株中与野生型菌株YML4-3中folQ基因的相同位置，得到回补型菌株HBQ；

(3)使用qPCR方法测定YML4-3、△fol Q和HBQ菌株叶酸合成途径中相关基因的相对表达量；