[发明专利]一种植物乳杆菌的基因在叶酸生物生成中的应用

权利要求书

1.一种folQ基因在植物乳杆菌(L.plantarum)叶酸生物生成中的应用，其特征在于：所述应用主要通过以下步骤：

(1)使用同源重组的方法，定向敲除植物乳杆菌野生型菌株YML4-3菌株叶酸合成DHPPP途径中的folQ基因，得到folQ基因敲除菌株△fol Q；

(2)仍使用同源重组方法将folQ基因回补至△folQ菌株中与野生型菌株YML4-3中folQ基因的相同位置，得到回补型菌株HBQ；

(3)测定三株菌生长情况、抑制病原菌情况；

(4)使用qPCR方法测定YML4-3、△fol Q和HBQ菌株叶酸合成途径中相关基因的相对表达量；

(5)使用LC-MS测定三株菌不同时间点产生的叶酸含量，fol Q基因主要影响单谷氨酸叶酸的合成。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)中的同源重组方法中均使用温度敏感型质粒pFED760为骨架，构建载体。

3.根据权利要求1所述的，其特征在于：所述步骤(1)中folQ基因进行同源臂克隆后以质粒pFED760为骨架构建敲除载体，并将敲除载体转化YML4-3菌株感受态细胞完成基因敲除。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述folQ基因进行同源臂克隆的具体方法是先使用CTAB/酶法提取YML4-3基因组DNA，然后利用重叠PCR技术得到folQ基因上下游同源片段。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述以质粒pFED760为骨架构建敲除载体是使用试剂盒进行质粒提取，并使用酶切方法得到酶切产物，纯化后连接目的片段和pFED760质粒，并使用PCR法筛选重组菌株，获得重组质粒。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述敲除载体转化YML4-3菌株感受态细胞完成基因敲除的具体步骤为：使用温度敏感型质粒pFED76进行基因敲除，并将YML4-3菌株接种至培养基中制备感受态细胞，敲除载体转化感受态细胞并整合至YML4-3基因组中，最后敲除载体从基因组汇总脱离，完成基因敲除。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤(2)中敲除菌株fol Q基因的回补中以野生型YML4-3菌株总DNA为模板，引物扩增含有folQ基因及其上下游片段的目的序列。