[发明专利]一种诱导型碱基编辑系统及其应用

说明书

本发明公开了一种诱导型碱基编辑系统及其应用。该碱基编辑系统包括可诱导的人来源胞嘧啶脱氨酶(A3A)与单切口活性的SpCas9组成；脱氨酶能基于潜在的氨基酸位点进行拆分；雷帕霉素通过FRB/FKBP与氨基酸拆分位点的N端和C端相互作用而重组装分裂的脱氨酶，并诱导完成碱基编辑。本申请通过构建诱导型碱基编辑系统来控制其碱基编辑活性，从而减少脱靶编辑；同时，本申请中的拆分设计不会减少目标编辑，因此，可以作为蛋白质突变的补偿策略，并且可以与这些突变的脱氨酶结合使用，以进一步减少脱靶编辑。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种诱导型碱基编辑系统及其应用。

背景技术

碱基编辑是一种基因组编辑策略，可直接在基因组DNA中转换特定的单个核苷酸(Rees and Liu 2018)。目前，碱基编辑器有两种类型，胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，两者都由脱氨酶与催化缺陷的Cas9蛋白组成，该酶可催化胞嘧啶或腺嘌呤的脱氨反应。在sgRNA的指导下，碱基编辑器可以在靶点内特定窗口的几个碱基对中将C-G碱基对转换为T-A碱基对，或将A-T碱基对转换为G-C碱基对。因为它高效且精确，并且不会产生由DNA双链断裂(DSB)引入的插入或缺失等副产物，所以该技术很快被广泛用于各种模式生物中，例如小鼠，斑马鱼，拟南芥和酿酒酵母。

尽管碱基编辑技术在广泛的基础研究中取得了许多令人振奋的成果，但是碱基编辑在临床应用中仍然存在一个主要阻碍，即在DNA或RNA水平上的脱靶效应。当前的CBE和ABE通常会引起RNA中全转录组范围内的脱靶，引起了对安全性问题的关注。更严重的是，由于CBE还会造成DNA水平的脱靶，可能进一步导致包括癌症在内的病理状况。实际上，早在三十多年前，研究人员发现过表达APOBEC1(CBE中使用的最流行的胞嘧啶脱氨酶之一)可导致转基因小鼠患上肝癌。随后，AID也被发现在小鼠中过表达会诱导肿瘤的发生。基于这些发现，越来越多的研究证实了胞嘧啶脱氨酶与多种组织中的肿瘤发生之间的联系。已发现的胞嘧啶脱氨酶的成员中，如APOBEC3B，在多种实体瘤。

已发现胞嘧啶脱氨酶的过表达能够诱导基因组DNA中的碱基替换，从而损害基因组稳定性。更重要的是，已发现许多肿瘤细胞带有以胞嘧啶标记为特征的SNV。因此，不受控制的碱基编辑器(尤其是CBE)可能会产生肿瘤。考虑到AAV是目前最有效的体内传递载体之一，AAV注射后会使转基因在体内长期表达，使用这种载体传递碱基编辑器无疑会放大脱靶后果。因此，我们迫切需要探索活性可控的新型碱基编辑工具。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种诱导型碱基编辑系统及其应用，通过构建拆分式碱基编辑系统，并能通过雷帕霉素的诱导来控制其碱基编辑活性，通过该方案能够有望缩短编辑时间。同时，本申请中的拆分设计不会减少目标编辑，因此，可以作为蛋白质突变的补偿策略，并且可以与这些突变的脱氨酶结合使用，以进一步减少脱靶编辑。

近年来，许多研究表明碱基编辑器存在的DNA和RNA的脱靶效应。本发明通过控制脱氨酶活性进而控制碱基编辑器的编辑编辑活动，从而降低脱靶效应。本发明的碱基编辑系统包括可诱导的人源胞嘧啶脱氨酶(A3A)与单切口活性的SpCas9。具体方案为：将A3A分裂为失活的N端和C端后，分别与FRB和FKBP蛋白融合，FRB和FKBP在雷帕霉素诱导下形成稳定的三元复合物，从而使脱氨酶重新组装成有功能性的A3A。由于脱氨酶的活性可受诱导剂调控，进而该碱基编辑器的活性是可控的。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种诱导型碱基编辑系统，碱基编辑系统包括碱基编辑器，以及与其结合的雷帕霉素；碱基编辑器包括脱氨酶；

脱氨酶能基于任一氨基酸位点进行拆分；雷帕霉素通过拆分后的氨基酸位点与脱氨酶结合，并诱导完成碱基编辑。

进一步地，碱基编辑器为由脱氨酶和BE3/SpCas9组成的碱基编辑器。