[发明专利]一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法

说明书

一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法。现有技术用光密度计对按分子量顺序分离开的酪蛋白与乳清蛋自各谱带进行测定，求得酪蛋白与乳清蛋白的含量比率，测定结果准确性和精密度差。本发明其方法包括如下步骤：将被测样品经6mol/L盐酸于110℃水解22小时，水解溶液定容50mL后过滤，样品滤液和标准品溶液同时用衍生剂衍生，衍生物经高效液相色谱仪或超高效液相色谱仪分离、紫外检测器检测，测定出缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量，样品中酪蛋白含量与其所含的两种氨基酸含量比值存在二次函数的曲线关系，用不同含量的酪蛋白值与其所含的缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸中两种氨基酸比值制作两个定量曲线方程。本发明用于测定婴儿配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法。

技术领域

本发明涉及婴儿乳粉配方技术领域，具体涉及一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法。背景技术

目前使用GB/T 5413.2- 1997《婴幼儿配方食品和乳粉乳清蛋白的测定》，测定婴儿配方粉中酪蛋白/乳清蛋白的比例,试样用SDS-聚苯烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE,Laemmli法)后，现有技术用光密度计对按分子量顺序分离开的酪蛋白与乳清蛋白各谱带进行测定，求得酪蛋白与乳清蛋白的含量比率，该项技术可操作性差，测定结果准确性和精密度差。本申请填补了婴儿配方乳粉酪蛋白和乳清蛋白测定的技术缺陷，可操作性强、大大提高了方法的准确性和精密度。

发明内容

本发明的目的是提供一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法，该方法是配制一组定量样品，选择三种氨基酸，同时制作两条定量曲线，能够达到测定效率高，事半功倍的功效。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

一种测定配方乳粉中酪蛋白含量的双曲线法，该方法包括如下步骤：首先是将被测样品经6mol/L盐酸于110℃水解22小时，水解溶液定容50mL后过滤，样品滤液和标准品溶液同时用衍生剂衍生，衍生物经高效液相色谱仪或超高效液相色谱仪分离、紫外检测器检测，测定出缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸的含量，样品中酪蛋白含量与其所含的两种氨基酸含量比值存在二次函数的曲线关系，用不同含量的酪蛋白值与其所含的缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸中两种氨基酸比值制作两个定量曲线方程，将被测样品中测得的相应氨基酸比值分别带入相应的曲线方程，计算出两个酪蛋白含量值，取平均值为测定结果；

（1）试样的制备

A、氨基酸试样制备：称取适量样品，其中蛋白质含量为10.0～30.0mg，置于带密封垫螺纹盖水解管中，向水解管内加45℃～50℃的温水6mL，轻轻震荡溶解样品，再加入浓盐酸6 mL，轻震混匀，充入氮气1min后，拧紧螺丝盖，将水解管放在110℃±1℃的恒温干燥箱内水解22 h后取出冷却至室温；将水解液用超纯水转移并定容至50 mL容量瓶中，残液洗三次，洗液合并后定容，混匀，滤纸过滤，吸取滤液1 mL放入指型瓶中，在60 ℃±2 ℃氮吹仪上浓缩至干或在低于50 ℃下减压蒸馏至干，残留物用1 mL超纯水溶解，即为试样溶液；

B、游离氨基酸试样制备：准确称取混合均匀的样品约2.5 g，精确至0.0001 g放入100 mL锥形瓶中，加入约25 mL45 ℃~50 ℃温水溶解，降至室温后用盐酸溶液调节样品溶液的pH值至1.7±0.1，放置约1 min，再用氢氧化钠溶液调节样品溶液的pH值至4.5±0.1，超声振荡约10 min，用水转移并定容至50 mL容量瓶中混匀，滤纸过滤后经0.22 μm滤膜过滤，滤液即为试样溶液；

（2）曲线的制作

A、氨基酸标准曲线制作：将标准工作液衍生液注入到超高效液相色谱仪或高校液相色谱仪中，得到氨基酸标准工作液的峰面积，以标准工作液的峰面积为纵坐标，以标准工作液浓度μmol/mL为横坐标绘制标准曲线，该曲线用于计算各氨基酸浓度和含量，其中含量以每100克蛋白质中氨基酸所含克数表示。

、样品定量计算的双曲线制作：以配制的不同酪蛋白含量为纵坐标，以上机测定后得到的缬氨酸/丙氨酸、缬氨酸/脯氨酸或其比值的倒数为横坐标，分别制定两个定量计算曲线，即双曲线，得到两个曲线方程，要求相关系数平方值≥0.9980；

（3）样品溶液的测定