[发明专利]碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法

说明书

本发明涉及蛋白质工程领域，特别涉及碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法。本发明的突变体是在SEQ ID No.1所示的氨基酸的基础上，将第253位丙氨酸突变成赖氨酸。本发明得到的突变体在毕赤酵母中表达，摇瓶培养后，测定该突变体比酶活为6290U/mg，相比较野生型比酶活提高了18％左右。本发明的碱性蛋白酶2018突变体可以广泛应用于各种领域。

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，特别涉及碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法。

背景技术

碱性蛋白酶2018是一种来自于林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)的丝氨酸蛋白酶，分子量约为28.9kDa。碱性蛋白酶2018具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，对天然蛋白质具有广谱高效的切割能力，该酶偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键，从而将蛋白质大分子降解为氨基酸和短肽。该酶的最适反应条件是37℃，pH7.5-9.0，同时能够在广谱的pH和温度条件下保持高活性，并且对SDS、尿素等具有一定的抗性，因此在洗涤业、饲料行业，以及污水处理、造纸、食品等领域均展现出良好的应用效果。

1989年Gunkel等第一次实现了碱性蛋白酶2018在大肠杆菌细胞中的异源表达，并对其基本性质进行了研究。随着技术的进步，碱性蛋白酶2018的晶体结构被解析出来，发现其含有两个Ca²⁺结合位点以及两对二硫键，相比于其他蛋白酶，其活性、热稳定性、酸碱耐受性和底物谱均有较大优势，但该蛋白在林伯氏白色念球菌中的表达量却十分低，使其难以运用于实际生产中。为了进一步提高碱性蛋白酶2018的表达水平，本团队前期工作实现了碱性蛋白酶2018在毕赤酵母中的高效分泌表达，重组蛋白表达水平达到约8mg/mL，酶活达到约100000U/mL。与此同时，碱性蛋白酶2018分子的改造也取得了突破。Jeremy Minshull的团队在2007年通过机器学习的方法筛选到6个比活力提高10倍以上的突变体，大幅提高蛋白酶K的活性和稳定性。2020年，Tao Tu团队通过理性设计获得R218S突变体，该突变体的比酶活提高15％以上，而且60℃，1h孵育后的残余酶活是野生型的1.6倍左右。以上成果为碱性蛋白酶2018的应用提供重要技术支撑。

现有碱性蛋白酶2018在碱性条件下活性高，并且能够耐受一定浓度的去污剂，在洗涤行业具有很好的应用前景，但是该酶与国外商品化洗涤用蛋白酶相比，活性还有一定差距。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了碱性蛋白酶2018突变体及其制备方法。本发明通过理性设计的方法对该蛋白酶分子进行改造，提高了它的比活性，为其在洗涤行业的应用提供了可能。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了碱性蛋白酶2018突变体，野生型碱性蛋白酶2018的第253位氨基酸被取代。野生型碱性蛋白酶2018的第253位丙氨酸被赖氨酸取代。所述野生型碱性蛋白酶2018具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。所述野生型碱性蛋白酶2018由如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码。

在本发明的一些具体实施方案中，所述的碱性蛋白酶2018突变体具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：

(Ⅰ)碱性蛋白酶2018突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；

(Ⅱ)与SEQ ID No.3具有至少70％同一性的序列或经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

(Ⅲ)由如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；

所述取代为取代1个氨基酸。