[发明专利]一种分离纯化微孢子虫极管的方法

说明书

本发明公开了一种分离纯化微孢子虫极管的方法，具体步骤为：a)微孢子虫体外发芽，震荡破碎，使孢壳与极管分离；b)将步骤a)得到的样品按500rpm‑6000rpm进行差速离心，3500rpm‑6000rpm之间收集到的沉淀样品即为纯化的极管。本发明纯化的极管纯度较高，杂质较少，而且操作简单，耗时较短。

技术领域

本发明属于微生物细胞器官分离技术领域，具体涉及一种分离纯化微孢子虫极管的方法。

背景技术

微孢子虫(Microsporidia)是一类营细胞内专性寄生可形成孢子的单细胞真核生物，广泛存在于动物界，宿主包括无脊椎动物、脊椎动物，乃至人类。尽管微孢子虫在宿主范围和专一性方面存在差异，但它们都具有相似的侵染机制。在适宜的外界环境刺激下，微孢子虫能迅速弹出极管(Polar tube)，并通过中空极管将病原性孢原质输送到宿主细胞内，进而进行感染增殖。因此，极管成为了微孢子虫一种独特的侵染器官。极管呈管状结构，具有一定的弹性和韧性，其直径为100～200nm，长度可达50～500μm。由于微孢子虫完成整个发芽、弹出极管、运输孢原质过程极短(小于2秒)，目前对于极管弹出机制的研究变得十分困难。

极管具有特殊的溶解性，不溶于SDS、H₂SO₄等一般的离子去污剂，而溶于不同浓度的β-巯基乙醇、DTT等还原剂。研究者们通常利用极管的这种特殊溶解性和蛋白质组学的手段，从多种属微孢子虫中鉴定得到了6种极管蛋白(PTP1-PTP6)。其中PTP1、PTP2和PTP3定位于整根极管，并且三者间具有相互作用，推测三者发挥稳固极管结构的作用。PTP4定位于极管最前端，EhPTP4被证实具有明显的细胞结合能力，并鉴定到EhPTP4的宿主细胞受体：转铁蛋白受体1(Transferrin receptor 1，TfR1)。研究表明，敲除了TfR1基因后，微孢子虫的感染率明显降低。2020年，在家蚕微孢子虫中鉴定到能定位于整根极管上的新极管蛋白6，而且发现NbPTP6与EhPTP4类似，具有明显的宿主细胞结合能力，推测该蛋白在微孢子虫侵染宿主过程中发挥重要功能。

极管蛋白功能的研究和极管结构的解析对于探究微孢子虫的侵染机制具有重要意义。但是目前获得微孢子虫新极管蛋白的方法还局限于使用各种溶剂溶解发芽后的孢子，并结合蛋白质质谱来筛选潜在的极管蛋白。具体方法参见Bing Han等人2019发表的《Microsporidia Interact with Host Cell Mitochondria via Voltage-DependentAnion Channels Using Sporoplasm Surface Protein 1》，以及Bing Han 2017年发表的《Microsporidia:Obligate Intracellular Pathogens within the Fungal Kingdom》。由于前期样品不纯，常混有微孢子虫空壳、未发芽的孢子、细胞核、孢原质等杂质，为后续蛋白质质谱数据的有效筛选增添了难度。同时，目前大多采用冷冻电镜技术解析微孢子虫极管的超微结构，观察的样品是微孢子虫体外发芽后连有极管的孢子空壳，由于孢壳体积过大，其直径约为极管直径的数十倍，此样品的冷冻效果会受到极大影响，最终影响对极管超微结构观察，因此亟需一种分离纯化微孢子虫极管的方法。

发明内容

针对以上存在的问题和不足，本发明的目的在于提供一种直接分离纯化微孢子虫极管的方法，为日后鉴定新的极管蛋白和解析极管超微结构提供便利。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种分离纯化微孢子虫极管的方法，具体步骤如下：

a)微孢子虫体外发芽，震荡破碎，使孢壳与极管分离；

b)将步骤a)得到的样品按500-6000rpm进行差速离心，收集3500rpm-6000rpm之间的沉淀样品即为纯化的极管。

作为优选方案之一，步骤a)中，体外促发芽使用的方法为置于0.1M的KOH溶液中，30℃萌发40min。