[发明专利]一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法

说明书

本发明公开了一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法，包括如下步骤：S1.制备目标抗原并采用目标抗原对动物进行免疫；S2.免疫完成后取动物脾脏，采用流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞，制成单细胞悬液；S3.将单细胞的mRNA进行扩增逆转录合成cDNA，扩增抗体重链和轻链的可变区，分别连接至载体；S4.进行细胞转染，即得到单克隆抗体稳转表达细胞株。由本发明方法制备得到的细胞株相较于传统的杂交瘤细胞株稳定，并且分泌的抗体的批次间生产稳定，产量比杂交瘤细胞株高10‑50倍以上，能广泛应用工业化生产。

技术领域

本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，具体涉及一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法。

背景技术

传统的单克隆抗体制备方法是通过抗原免疫小鼠或兔子等动物体后，通过将脾脏B细胞与肿瘤细胞(S/p20)融合后进行单细胞筛选，进而获取具有分泌针对目标抗原的杂交瘤细胞。该传统的方法的缺陷在于：(1)由于B细胞和肿瘤细胞的融合转化率并不是100％，所以融合过程中很多可以识别目标抗原的B细胞由于融合失败，无法通过上述方法获得这些克隆；(2)杂交瘤细胞本身较不稳定，不同的杂交瘤细胞的抗体表达量差异很大，传代多次后容易丢失目标抗体；(3)合成杂交瘤细胞后进行单克隆的目标抗体筛选会耗费大量的人工，而且一定程度上是否能够获得针对目标抗原的杂交瘤细胞取决于运气，传统方法获得阳性克隆的成功率不高。综上，传统方法一直存在着融合效率低、随机性大，实验过程中阳性率较低，需要多次细胞融合，从而增大了工作量；此外，杂交瘤细胞体内培养需要借助实验动物完成，实验动物培养成本高，而且动物个体差异大容易导致批间差，不利于工业化生产。因此，需要开发一种能稳定获得大量单克隆抗体的新方法。

在近几年的单克隆抗体制备方法中，有报道采用免疫原对一种动物进行免疫，获得脾脏B细胞后，进行后续稳转细胞株和单抗的制备。例如专利CN110655576A公开了一种IL-6重组单克隆抗体及其制备方法和应用，其制备方法包括如下步骤：以IL-6免疫小鼠，免疫完成后取小鼠的脾脏，制成单细胞悬液；通过流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞；对所得细胞进行分别培养，再将所得培养物上清液加入到包被IL-6的培养装置继续培养，检测出分泌特异性抗体的细胞株，筛选出可以特异性识别抗原蛋白的抗体克隆；对所得细胞株进行总RNA的抽提，并反转录成cDNA，扩增抗体重链和轻链的可变区，分别连接至载体；然后进行细胞(CHO细胞)转染，生产IL-6重组单克隆抗体。又例如专利CN111995683A公开了一种抗PD-L1蛋白单克隆抗体、细胞株及其制备方法和应用，该抗体的制备方法包括以下步骤：免疫原制备、免疫实验兔、构建抗体cDNA文库并筛选、噬菌体单链抗体库筛选得到可变区序列、构建表达PD L1的CHO细胞株并筛选、细胞株大量生产单克隆抗体。虽然以上两种方法都获得了稳定表达相应单克隆抗体的细胞株，但由于前期采用的均是一种免疫原免疫一种动物，因此获得的脾脏B细胞种类较少，获得目标抗原抗体的成功率也较低。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法，由本发明方法制备得到的细胞株相较于传统的杂交瘤细胞株稳定，并且分泌的抗体的批次间生产稳定，产量比杂交瘤细胞株高10-50倍以上。

为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供一种高通量合成单克隆抗体稳转表达细胞株的方法，包括如下步骤：

S1.制备目标抗原并采用目标抗原对动物进行免疫；

S2.免疫完成后取动物脾脏，采用流式细胞仪筛选出记忆B细胞及浆细胞，制成单细胞悬液；

S3.将单细胞的mRNA进行扩增逆转录合成cDNA，扩增抗体重链和轻链的可变区，分别连接至载体；

S4.进行细胞转染，即得到单克隆抗体稳转表达细胞株。

优选地，步骤S1中所述的目标抗原包括但不限于人IL6、IL2、CD3、CD4或CD8蛋白中的任意一种。