[发明专利]一种细胞色素P450单加氧酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种细胞色素P450单加氧酶突变体及其应用。本发明提供的细胞色素P450单加氧酶突变体L84Q/D93A对石胆酸的羟化活力为5.6U/mg，是野生型CYP活力的42.4倍，具有较高的催化活性和稳定的催化效果，随着底物浓度的提升至500mmol/L，L84Q/D93A仍然能在24h将石胆酸进行完全转化。因此，本发明所述细胞色素P450单加氧酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种细胞色素P450单加氧酶突变体及其应用。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)，化学名为3a,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，为白色粉末状固体，分子式为C₂₄H₄₀O₄，分子量为392.57，CAS号为128-13-2，熔点为203℃，沸点为547℃，几乎不溶于水。

熊去氧胆酸已被广泛应用于医药领域，用于治疗治疗胆结石、胆汁淤积性肝病、脂肪肝、各型肝炎、中毒性肝障碍、胆囊炎、胆道炎和胆汁性消化不良、胆汁返流性胃炎、眼部疾病等。熊去氧胆酸的合成有化学法和生物法两种。其中化学合成法一般采用从胆酸出发七步合成或从非胆酸类甾体出发来完成熊去氧胆酸的制备，此两种方法都存在反应收率低、产物纯度低、生产成本高的缺点，难以工业化生产。与化学法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、经济和环境效益较高等优点。生物法包括动力学拆分和合成。

生物合成法研究较多的是用野生菌或重组工程菌的整细胞或游离酶进行催化。Catherine Juste等报道了从人体排泄物中分离得到的五种菌都能将鹅脱氧胆酸转化为熊去氧胆酸，经过基因序列比对确定这五种菌都是Clostridium baratii。五种菌在培养48h后，熊去氧胆酸最高产率为75.9％，最低产率为52.0％；Ian A.Macdonald等人成功分离8种野生菌(Clostridium absonum)，它们都同时包含7α-和7β-HSDH，利用这些野生菌能将胆酸转化成熊胆酸或将鹅脱氧胆酸转化成熊脱氧胆酸。但是整细胞转化胆酸或鹅脱氧胆酸的浓度分别低于1.5mM和0.5mM，更高浓度则会抑制细胞生长和底物转化。分别培养15-22h和9-15h后产率为60-70％；SergioRiva等报道了从胆酸一锅煮合成12-羰基-熊去氧胆酸的方法，反应中混合了五种酶，其中三种酶是：7α-HSDH克隆自B.fragilis菌株、12α-HSDH来源于未知序列的商业途径和7β-HSDH克隆自C.absonum，其中前两种酶起氧化作用，属于NADH依赖型，7β-HSDH起氧化作用，属于NADPH依赖性，通过不同的辅酶依赖性，结合不同的辅酶循环实现一锅煮。为了NAD⁺的再生，采用了乳酸脱氢酶/丙酮酸系统，同样为了NADP⁺的再生，采用了来源于Thermoplasma acidophilum的高度NADPH依赖性的葡萄糖脱氢酶。反应5h之后胆酸完全转化为12-羰基-熊去氧胆酸，但是24h之后又有中间产物出现，所以没有实现真正的一锅煮；DirkWeuster-Botz等研究将3α-HSDH和7β-HSDH以及FDH的基因整合到一个质粒上，研究了他们之间在质粒上不同位置对产酶的影响。利用新构建的整细胞催化脱氢胆酸合成12-羰基-熊去氧胆酸，可以在21h内将70mM的脱氢胆酸99％转化为12-羰基-熊去氧胆酸。该批产品分离后的纯度是95％。

然而，以上方法仅限于实验室规模，且存在羟化酶的自身活力低，产物浓度不高，步骤繁琐以及酶热稳定性差等缺陷，不适合工业化生产熊去氧胆酸。因此，筛选活力高，且能在较短时间内获得较高产物浓度的细胞色素P450单加氧酶，以满足工业化生产熊去氧胆酸的需求具有非常重要的意义，本实验室筛选得到一种细胞色素P450单加氧酶，催化石胆酸生产熊去氧胆酸，底物石胆酸浓度达到50mmol/L，反应24h，产物摩尔收率为95.9％，光学纯度为99％(R)，但是底物浓度依然达不到工业生产的要求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种细胞色素P450单加氧酶突变体，活力较野生型有较大程度的提高，且底物浓度能够达到500mmol/L。