[发明专利]改良高盐-低pH法提取灯盏细辛叶绿体基因组DNA的方法

说明书

本发明公开了改良高盐‑低pH法提取灯盏细辛叶绿体基因组DNA的方法。本发明方法，包括如下步骤：(1)将经饥饿处理的灯盏细辛叶片加入缓冲液A中进行匀浆，过滤，收集滤液；对滤液进行第一次离心，收集上清液；对上清液进行第二次离心，收集绿色沉淀，得到粗叶绿体；(2)在步骤(1)得到的粗叶绿体中加入缓冲液B，轻悬，离心，收集沉淀，得到叶绿体；(3)在步骤(2)得到的叶绿体中加入缓冲液C，再加入蛋白酶进行温育，冷却；(4)从步骤(3)裂解后的体系中提取叶绿体DNA，得到叶绿体基因组DNA。本发明方法可简单、快速获取完整的叶绿体及叶绿体DNA，所得DNA结构完整、质量高、纯度好，未出现降解现象，能够满足后续测序工作的标准和要求。

技术领域

本发明涉及植物叶绿体基因组DNA提取方法，尤其涉及改良高盐-低pH法提取灯盏细辛叶绿体基因组DNA的方法。

背景技术

灯盏细辛又名灯盏花，为菊科多年生草本药用植物，是中国西南地区特有的物种，灯盏细辛的提取物和活性化合物已被广泛用于治疗脑栓塞、脑血栓、冠心病、心绞痛、急性肾衰竭和肾病综合征，具有极高的药用价值。但是由于连年的过度采挖与使用，极大地耗尽了灯盏细辛的野生资源。

叶绿体是植物进行光合作用的主要细胞器，作为一个半自主性遗传系统，叶绿体具有相对独立的遗传物质，即叶绿体DNA(cpDNA)，在研究植物系统发育中具有十分广泛的作用。近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，植物叶绿体基因组的测序工作也取得了一定进展，为研究植物遗传多样性与遗传进化奠定了基础。当前，植物叶绿体基因组的提取方法有很多，如蔗糖密度梯度离心法，Percoll密度梯度离心法，和改良高盐-低pH法等。传统的密度梯度离心法更适合于提取禾本科和豆科植物的叶绿体DNA，但该方法提取成本较高，耗时长且DNA得率低，难以广泛应用。而改良高盐-低pH法具有可简单、快速获取完整的叶绿体及高质量叶绿体DNA的特点。

当前有关灯盏细辛叶绿体基因组的提取方法尚未见报道，且国内外对于灯盏细辛叶绿体基因组的研究甚少。因此，提取出高质量的灯盏细辛叶绿体基因组DNA，对探究灯盏细辛的遗传多样性，灯盏细辛种质资源的保护、评价及科学利用具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供改良高盐-低pH法提取灯盏细辛叶绿体基因组DNA的方法，利用该方法提取得到的DNA结构完整、质量高、纯度好，未出现降解现象，能够满足后续测序工作的标准和要求。

本发明提供的一种灯盏细辛叶绿体基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：

(1)叶绿体分离：将经饥饿处理的灯盏细辛叶片加入缓冲液A中进行匀浆，过滤，收集滤液；对所述滤液进行第一次离心，收集上清液；对所述上清液进行第二次离心，收集绿色沉淀，得到粗叶绿体；

(2)叶绿体纯化：在步骤(1)得到的粗叶绿体中加入缓冲液B，轻悬，离心，收集沉淀，得到叶绿体；

(3)叶绿体裂解：在步骤(2)得到的叶绿体中加入缓冲液C，再加入蛋白酶进行温育，冷却；

(4)叶绿体DNA的提取：从步骤(3)裂解后的体系中提取叶绿体DNA，得到所述叶绿体基因组DNA。

上述的制备方法，步骤(1)中，所述灯盏细辛叶片与所述缓冲液A的比例可为20g：60～100mL。具体可为20g：100mL；

所述缓冲液A的pH值可为3.8；所述缓冲液A可由下述组分组成：1.25mol/L NaCl，0.25mol/L抗坏血酸，10mmol/L焦亚硫酸钠，50mmol/L pH值为8.0的Tris-HCl，7mmol/L pH值为8.0的EDTA，1％w/v的PVP-40(1％w/v表示质量浓度为10g/L，PVP-40表示K值为40的聚乙烯吡咯烷酮)，0.1％w/v牛血清白蛋白，1mmol/L二硫苏糖醇和余量的水。