[发明专利]改良高盐-低pH法提取灯盏细辛叶绿体基因组DNA的方法

权利要求书

1.一种灯盏细辛叶绿体基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：

(1)叶绿体分离：将经饥饿处理的灯盏细辛叶片加入缓冲液A中进行匀浆，过滤，收集滤液；对所述滤液进行第一次离心，收集上清液；对所述上清液进行第二次离心，收集绿色沉淀，得到粗叶绿体；

步骤(1)中，所述灯盏细辛叶片与所述缓冲液A的比例为20g：60～100mL；

所述缓冲液A的pH值为3.8；所述缓冲液A由下述组分组成：1.25mol/L NaCl，0.25mol/L抗坏血酸，10mmol/L焦亚硫酸钠，50mmol/L pH值为8.0的Tris-HCl，7mmol/L pH值为8.0的EDTA，1％w/v PVP-40，0.1％w/v牛血清白蛋白，1mmol/L二硫苏糖醇和余量的水；

步骤(1)中，所述第一次离心的离心力为500×g，时间为10～20min；

所述第二次离心的离心力为2500×g，时间为12min；

(2)叶绿体纯化：在步骤(1)得到的粗叶绿体中加入缓冲液B，轻悬，离心，收集沉淀，得到叶绿体；

步骤(2)中，所述缓冲液B的pH值为8.0；所述缓冲液B由下述组分组成：1.25mol/LNaCl，50mmol/L pH值为8.0的Tris-HCl，25mmol/L pH值为8.0的EDTA，1％w/v PVP-40，0.1％w/v牛血清白蛋白，1mmol/L二硫苏糖醇和余量的水；

步骤(2)中，所述离心的离心力为2500×g，时间为12min；

(3)叶绿体裂解：在步骤(2)得到的叶绿体中加入缓冲液C，再加入蛋白酶进行温育，冷却；

步骤(3)中，所述缓冲液C的pH值为8.0；所述缓冲液C由下述组分组成：50mmol/L Tris-HCl，25mmol/L pH值为8.0的EDTA，1.25mol/L NaCl，2.0％十二烷基硫酸钠和余量的水；

(4)叶绿体DNA的提取：从步骤(3)裂解后的体系中提取叶绿体DNA，得到所述叶绿体基因组DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述提取的步骤如下：采用溶剂Ⅰ对步骤(3)裂解后的体系进行抽提，混匀后进行第一次离心，收集上清液，得上清液Ⅰ；

在所述上清液Ⅰ中加入溶剂Ⅱ进行第二次离心，收集上清液，得上清液Ⅱ；

在所述上清液Ⅱ中加入溶剂Ⅲ，混匀后沉降，进行第三次离心，收集沉淀，得到所述叶绿体基因组DNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述裂解后的体系与所述溶剂Ⅰ的体积相等；所述溶剂Ⅰ由体积比为25：24：1的苯酚、氯仿和异戊醇组成；所述第一次离心的离心力为10000～12000×g，时间为10～20min；

所述上清液Ⅰ与所述溶剂Ⅱ的体积相等；所述溶剂Ⅱ由体积比为24：1氯仿和异戊醇组成；所述第二次离心的离心力为10000～12000×g，时间为10～20min；

所述上清液Ⅱ与所述溶剂Ⅲ的体积相等；所述溶剂Ⅲ为异丙醇；所述第三次离心的转速为10000～12000×g，时间为20～30min。