[发明专利]一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法

说明书

本发明公开一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，包括如下步骤：步骤S1、原料的粗处理；步骤S2、盐析；步骤S3、亲和层析；(1)将制得的样品与明胶按照2∶5‑10的体积比混合，之后在30‑35℃下孵育1h，孵育结束后用PBS缓冲液洗涤三次；(2)之后通过含有2.5MUrea的10mMPBS缓冲液进行洗脱，直至将吸附在明胶上的样品洗脱；步骤S4、凝胶过滤层析；本发明一种胎儿纤维连接蛋白在制备过程中使用到的纤维连接蛋白来源于人脐带血，制备出的蛋白为天然蛋白，具有更好的免疫原性；本发明提取出的纤维连接蛋白纯度与收率更高；本发明所使用到的纯化方法有效的保持了目的蛋白的结构和功能。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法。

背景技术

胎儿纤维连接蛋白fFN是人体20余种纤维连接蛋白的一种，孕妇血循环及羊水中富含fFN，它是由蜕膜和绒毛之间的细胞外基质产生的复合物，可能与受精卵的种植及胎盘与蜕膜间的粘附有关。当绒毛膜与蜕膜融合完毕(约20周)后fFN很少测到或在50ug/L以下，近足月时升高。若孕20-37周宫颈阴道分泌物fFN≥50ug/L，则早产可能性较大。同时fFN也是某些肿瘤早期标志物之一。为更好的检测fFN，在此利用盐析、亲和层析、凝胶过滤层析等方法开发出一种工艺用于提取天然来源的fFN，并将其作为后期制备单抗的免疫原。

发明内容

为了更好的检测fFN，本发明提供一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法。

本发明一种胎儿纤维连接蛋白在制备过程中使用到的纤维连接蛋白来源于人脐带血，制备出的蛋白为天然蛋白，具有更好的免疫原性；本发明提取出的纤维连接蛋白纯度与收率更高；本发明所使用到的纯化方法有效的保持了目的蛋白的结构和功能。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1、原料的粗处理：

(1)将孕妇脐带血在30-35℃下静置直至凝固，之后对凝固后的孕妇脐带血进行离心，控制离心的转速为3000rpm，离心时间为10min，离心温度为4℃；

(2)收集离心后的孕妇脐带血中的血清组分，备用；

步骤S2、盐析：

(1)向收集的血清组分中加入固体硫酸铵，以2000-3000rpm的转速离心5-10min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置10min，收集上清液，备用；

(2)向收集的上清液中再次加入固体硫酸铵，以3000-5000rpm的转速离心5-10min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置10min，收集沉淀；

(3)将收集的沉淀加入10mMPBS缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在PBS缓冲液中透析，制得样品；

步骤S3、亲和层析：

(1)将制得的样品与明胶按照2∶5-10的体积比混合，之后在30-35℃下孵育1h，孵育结束后用PBS缓冲液洗涤三次；

(2)之后通过含有2.5MUrea的10mMPBS缓冲液进行洗脱，直至将吸附在明胶上的样品洗脱。

步骤S4、凝胶过滤层析：

(1)将Sephacryl S-300按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的Sephacryl S-300凝胶，之后将Sephacryl S-300凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；

(2)使用含有2.5MUrea的10mM PBS缓冲液进行洗脱，控制洗脱的流速为1mL/min；