[发明专利]一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1、原料的粗处理：

(1)将孕妇脐带血在30-35℃下静置直至凝固，之后对凝固后的孕妇脐带血进行离心，控制离心的转速为3000rpm，离心时间为10min，离心温度为4℃；

(2)收集离心后的孕妇脐带血中的血清组分，备用；

步骤S2、盐析：

(1)向收集的血清组分中加入固体硫酸铵，以2000-3000rpm的转速离心5-10min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置10min，收集上清液，备用；

(2)向收集的上清液中再次加入固体硫酸铵，以3000-5000rpm的转速离心5-10min，离心温度为3-5℃，离心结束后静置10min，收集沉淀；

(3)将收集的沉淀加入10mMPBS缓冲液中，匀速搅拌直至完全溶解，之后在PBS缓冲液中透析，制得样品；

步骤S3、亲和层析：

(1)将制得的样品与明胶按照2∶5-10的体积比混合，之后在30-35℃下孵育1h，孵育结束后用PBS缓冲液洗涤三次；

(2)之后通过含有2.5MUrea的10mMPBS缓冲液进行洗脱，直至将吸附在明胶上的样品洗脱。

步骤S4、凝胶过滤层析：

(1)将Sephacryl S-300按照1∶10的重量比加水溶胀，控制溶胀时间为20h，溶胀后除去上清中的凝胶碎块，匀速搅拌10min，静置10min后再次除去上清中的凝胶碎块，重复三次，制得溶胀后的Sephacryl S-300凝胶，之后将Sephacryl S-300凝胶与和水按照3∶1的体积比加入柱内，搅拌均匀后上样；

(2)使用含有2.5M Urea的10mM PBS缓冲液进行洗脱，控制洗脱的流速为1mL/min；

(3)洗脱结束后分管收集并电泳，电泳结束后合并含有目的蛋白的样品，使用10mM PBS缓冲液透析并冷冻保存。

2.根据权利要求1所述的一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的pH7.2，该PBS缓冲液由如下方法制成：将浓度为0.2mol/L的磷酸二氢钾溶液50mL和浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液35mL混合，加入新沸过的冷水稀释至200mL，混合均匀，制得PBS缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述电泳的条件为：在恒流条件下，控制最大电压为300V，分离胶内电流为10mA，30min后样品前沿跑过分、浓界面后，调节电流为20-25mA，控制电泳时间为2h。

4.根据权利要求1所述的一种胎儿纤维连接蛋白的制备方法，其特征在于，步骤S2中(1)中控制体系的饱和度为20％，(2)中控制体系的饱和度为50％。