[发明专利]一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用

权利要求书

1.一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：菌株的分离纯化、菌株鉴定、Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物活性成分的提取、发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验，所述菌落特征为在马铃薯平板培养基(PDA培养基)上28℃生长15d后，菌落直径为90mm，菌落呈灰白色，环状；菌丝体稠密，表面呈绒毛状；菌落背面中心呈灰色，有径向裂纹，外部呈深棕色，并带有浅红色斑块，在培养过程中未形成分生孢子；分生孢子细胞为肠母细胞，菌落状，有多个分枝，透明光滑；菌丝体中形成不规则的黑色厚壁孢子，颜色为棕色或黑色，厚壁，常具球状突起，短链至长链。

2.根据权利要求1所述的一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述菌株的分离纯化方法如下：将采集的新鲜重楼块茎用75％乙醇和0.1％升汞消毒后接种于马铃薯琼脂平板上(添加了质量浓度为100μg/L的青霉素G钠和硫酸链霉素)，置于28℃霉菌培养箱中培养7天，挑取重楼块茎上生长出的菌丝接种于新的马铃薯琼脂平板上，再生长7天后，挑取菌落外围的菌丝接种于新的马铃薯琼脂平板上，反复转接3-5次，以获得纯种的菌种。

3.根据权利要求1所述的一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述菌株鉴定方法为：提取分离菌株的基因组DNA，并扩增其ITS及LSU序列，将扩增产物送测序部门，将获得的基因序列在NCBI上进行序列相似性比对分析，再使用MEGA7.0构建邻接(Neighbor-Joining)法系统发育进化树；结合菌株形态鉴定，并将将该菌株鉴定为Rhizopycnis vagum，并命名为AS6-ASP。

4.根据权利要求1所述的一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述Rhizopycnis vagum菌株发酵液粗提物活性成分的提取：将纯化好的菌株接种于液体发酵培养基(麦芽糖4g/L，天冬酰胺40g/L，KH₂PO₄ 1.52g/L，KCl 0.52g/L，MgSO₄·7H₂O0.52g/L，FeSO₄·7H₂O 0.001g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.001g/L，CuSO₄·5H₂O 0.001g/L，pH 6.0)中，置于全温振荡培养箱中28℃、200r/min培养6天，将发酵液6000r/min 4℃离心15min，收集上清，并用0.45μm和0.22μm的滤膜过滤；将过滤液用70％的硫酸铵进行沉淀，冰浴条件下搅拌1h，4℃条件下静置过夜；进一步将沉淀后的溶液12000r/min 4℃离心30min，收集沉淀，并溶解于少量的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)中；再用截留分子量为10kDa的超滤离心管4000r/min 4℃离心15min；将过滤后的溶液进行冷冻干燥成粉末，并冻于-80℃备用。

5.根据权利要求1所述的一株重楼内生真菌在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述发酵液粗提物活性成分的体外抗肿瘤实验方法如下：取对数生长期的CT26(结直肠癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)、HeLa(宫颈癌细胞)、和L02细胞(人正常肝细胞)接种于96孔板(每孔接种5×10³个细胞，100μL/孔)，37℃，5％CO₂培养箱中孵育24小时；用不含血清的DMEM培养基对接种细胞进行饥饿处理24小时，使所有细胞同步于细胞周期的G0/G1期；将冷冻干燥后的样品用含2％血清的DMEM培养基的配成5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL、0.078125mg/mL 7个药物浓度进行给药处理48h，用相同浓度的Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)作为对照，每个浓度设置5个副孔，阴性对照组为有细胞但不给药的无血清培养基，空白对照组为无细胞不给药的无血清培养基，培养结束后，小心吸弃上清，将无血清DMEM培养基与CCK-8溶液按9：1的比例配置成溶液，并向每孔里面加入100μL，继续培养2小时，酶标仪450nm条件下测定OD值，根据公式：细胞存活率＝[(A实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％即可求得细胞存活率，细胞存活率越低，药物抑制作用越大。