[发明专利]一种新型组成型启动子、重组地衣芽孢杆菌及其应用

说明书

发明公开了一种新型组成型启动子、重组地衣芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过PCR获得Bacillus licheniformis来源的强组成型启动子P2以及Thermobifida fusca NTU22来源的麦芽三糖淀粉酶目的基因，构建重组质粒pHY‑P2‑tfa，并转化至地衣芽抱杆菌Bacillus licheniformis，得到重组地衣芽抱杆菌。本发明以食品安全的地衣芽孢杆菌为表达宿主，利用新型高活性启动子P2实现麦芽三糖淀粉酶的重组表达。混合碳源麦芽糊精60g/L，葡萄糖10g/L以及42℃的发酵条件更有利于产酶，重组菌发酵的最高酶活达到578.47U/mL。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，尤其是涉及一种新型组成型启动子、重组地衣芽孢杆菌及其应用。

背景技术

启动子是合成生物学的基本表达元件之一，在调控合成代谢中起着重要作用。在基因的表达过程中，RNA聚合酶能特异性识别并结合启动子的特定序列，从而控制基因转录表达的起始时间和表达强度。在工业微生物表达合成高附加值化合物时，启动子对合成途径的调控作用往往决定着生产效率。

启动子在真核和原核表达系统中的研究和应用已经比较成熟。在酵母中，组成型的PTEF、PHXT7和PGPD等启动子已应用于代谢工程在原核微生物中，大肠杆菌表达系统研究的最早，最成熟的是采用启动子T7、lac,tac的表达系统。随着分子生物学的发展，革兰氏阳性细菌芽孢杆菌逐渐被开发成为一类重要的原核表达系统。在枯草芽孢杆菌中应用最为广泛的是P43、Pxyl等启动子。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)作为一种有效的外源基因表达系统，具有发酵周期短，热稳定性好，蛋白分泌能力强等优势，被认定为生物安全GRAS(Generallyregarded as safe)菌株。地衣芽孢杆菌在酶表达、代谢产物合成方面有着很好的应用前景，用于生产蛋白酶，淀粉酶，果胶酶等工业酶以及抗生素、柠檬酸、谷氨酸等物质。

麦芽三糖淀粉酶(maltotriose-producingα-amylase)属于糖苷水解酶GH13家族。可作用于淀粉及相关多聚糖，生成的主要产物为麦芽三糖。麦芽三糖能抑制人体肠道里有害菌的生长和淀粉的老化，是一种具有营养保健功能的糖源。

发明内容

针对目前重要工业微生物地衣芽孢杆菌十分缺乏合成生物学标准化元件，现有启动子主要来源于枯草芽孢杆菌等模式微生物，表达异源基因效果不甚理想以及缺乏生产麦芽三糖淀粉酶的高效方法，本发明提供了一种来源于地衣芽孢杆菌的新型组成型P2启动子和麦芽三糖淀粉酶基因的重组质粒，可实现麦芽三糖淀粉酶在地衣芽孢杆菌食品安全型微生物宿主中的高效制备。

本发明的技术方案如下：

一种新型组成型启动子P2，所述组成型启动子P2来源于保藏编号为Bacilluslicheniformis ATCC14580，Bacillus licheniformis ATCC12759，Bacilluslicheniformis ATCC9945，Bacillus licheniformis ATCC13438或Bacilluslicheniformis ATCC9259的地衣芽孢杆菌中。

进一步的，所述新型组成型启动子P2的核苷酸序列见SEQ ID NO:1。

进一步的，一种重组地衣芽孢杆菌，所述重组地衣芽孢杆菌启动子为新型组成型启动子P2，且所述重组地衣芽孢杆菌含有麦芽三糖淀粉酶基因片段。

进一步的，所述重组地衣芽孢杆菌的重组表达载体为pHY-P2-tfa。

进一步的，所述pHY-P2-tfa是通过将权利要求1中所述新型组成型启动子P2克隆到pHY300-PLK质粒，并将权利要求3中所述麦芽三糖淀粉酶基因片段克隆到上述所得质粒中得到。

进一步的，一种重组地衣芽孢杆菌的构建方法，所述构建方法为：