[发明专利]一种新的蛋白重组策略及其在酶改造中的应用

说明书

本发明公开了一种新的蛋白重组策略及其在酶改造中的应用。本发明提供了一种多结构域蛋白重组方法，包括如下步骤：将若干个结构相似的多结构域蛋白进行结构域间的重组，得到重组蛋白；所述结构相似为利用TM‑align软件进行结构比对，比对TM score0.5。本发明通过对酶蛋白结构域进行重新组合构建的方法，快速高效地获得目标突变体。与传统的随机突变、定点饱和突变、DNA shuffling等获得蛋白质重组体或突变体的方法相比，多结构域重构法，针对性更强，更聚焦，突变库容量极小，筛选负担小。本发明通过定向改造的方法获得了酶活力和稳定性均提高的漆酶突变体，有望提高其在木质素降解、有机合成和染料脱色应用中的效率。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种新的蛋白重组策略及其在酶改造中的应用。

背景技术

随着生物技术的快速发展，酶蛋白已广泛应用于食品、化工、环境、能源等各领域，推动了工业与能源的可持续发展。但天然酶一般难以满足工业需求，需要通过定向进化这一手段对其性能进行改造，如：提高酶的活性、稳定性、底物特异性和立体选择性等。

定向进化是在实验室模拟自然进化的过程，在这过程中重要的一步就是建立一个高质量的突变库，供下游筛选。目前，虽然突变库构建方法已得到广泛开发，如：易错PCR、基因重组、CASTing、序列饱和突变等，但突变库质量较低，存在很多无义突变或重组，因此需要筛选较大容量的突变库才能得到目标突变体。这很大程度上限制了定向进化的高效进行。因此构建容量较小但高质量的突变库尤为重要。

结构域是因多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠而成的一个或多个相对独立的致密三维实体。从功能角度看，多结构域的酶蛋白活性中心往往都位于结构域之间，主要可能是因为通过结构域容易构建具有特定三维排布的活性中心，而且各个结构域之间常只有一段柔性肽链相连，使结构域间容易发生相对运动，有利于活性中心结合底物、别构中心结合调节物和发生别构效应，利于酶对反应的催化。

在多结构域蛋白质中，一些蛋白质的各结构域没有明确的功能分工或各结构域共同存在才得以行使功能。本领域技术人员通常认为各结构域之间的联系是不能被破坏的，即替换掉任意结构域很可能会使蛋白质整体失去功能。漆酶(EC 1.10.3.2)是一类多功能氧化酶，属于蓝多铜氧化酶家族，能够氧化多达250多种底物，具有广阔的工业应用前景，如：木质素的降解、染料脱色、有机污染物的降解、生物检测、高分子合成和食品工业等领域。漆酶对富含木质素的农作物秸秆的有效降解作用，不但可以解决环境问题，并且可得到木质素来源的多种芳香族化合物用作化学品合成的前体。漆酶利用分子氧通过自由基－催化反应机制氧化各种芳香族和非芳香族化合物，唯一副产物是水，被认为是绿色环保的生物催化剂。然而，天然来源的漆酶活力比较低，而且难以在工业应用环境下保持稳定，从而限制了漆酶的商业化生产以及用于大规模木质素降解和环境治理等。因此如何生产廉价、高效的漆酶(高活力，高稳定性)越来越受到国内外众多学者的关注。大部分漆酶具有三个结构域，4个铜离子参与反应，1个T1铜，位于结构域3，负责从底物上得电子；T1铜附近，分别位于结构域2和结构域3的4个loops区在蛋白结构表面形成浅壑供底物结合；2个T3铜和1个T2铜组成的三核中心区，位于结构域1和3的界面上，负责将来自T1铜的电子传递给O₂，生成水。漆酶的三个结构域结合在一起形成了界面间的活性中心，使漆酶获得生化活性。

发明内容

本发明申请人认为结构域间界面上氨基酸的相互作用会对酶催化功能影响很大，因此对结构域进行组合、重构将会很大程度上改变酶蛋白的催化性能及其稳定性等。因此，本发明首次提出了一种通过对结构域进行重构而对蛋白进行设计改造的理念，构建高质量、小容量的聪明突变库，达到快速改造目标蛋白的目的。

本发明要求保护一种多结构域蛋白重组方法。