[发明专利]一种梅毒螺旋体重组抗原、制备及应用

说明书

本发明属于梅毒螺旋体免疫检测技术领域。在梅毒螺旋体检测中，金标层析检测方法存在灵敏度低、特异性差的问题，而现有的解决方案存在漏检、检测结果受干扰的问题，为此本发明提供一种梅毒螺旋体重组抗原TP34S、制备方法及其应用，以TP17外膜蛋白为基础，通过对其进行定点氨基酸突变，并将二倍的基因序列连接到载体上，进行原核表达，使得TP17突变序列完成重复表达，使其抗原表位能够充分有效暴露，防止漏检，检测的特异性及产品的稳定性有明显的提高。

技术领域

本发明属于梅毒螺旋体免疫检测技术领域，具体涉及一种梅毒螺旋体重组抗原、制备及应用。

背景技术

梅毒螺旋体亦称苍白螺旋体(Treponemiapallidum，TP)是性病一一梅毒的病原体，临床上常用血清学方法检测梅毒螺旋体的感染。以往用非特异类脂质抗原(心磷脂)检测抗心磷脂抗体作为梅毒螺旋体感染的标志，如性病研究实验室(VDRL)法、不加热血清反应素试验(USR)和快速血浆反应素环状试验(RPR)等。这些方法虽较灵敏，但不特异，有假阳性反应，因而还需再进行确认试验。

以梅毒螺旋体为抗原的特异性检测方法有梅毒螺旋体荧光抗体吸附试验(FTA-ABS)和梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)，其特异性和灵敏度均较高。但由于梅毒螺旋体培养困难，试剂的成本较高而且由于梅毒螺旋体抗原较复杂，与其他病原体，尤其是类似的螺旋体病(如雅司病)仍可有一定的非特异性反应。

鉴于以上情況，科学家们开始用重组蛋白质作抗原的特异性检测方法。随着科学技术的发展，梅毒全基因组序列已得到确定，随着基因克隆技术的发展，用梅毒重组蛋白质为抗原的免疫测定方法也己被陆续应用，如免疫俘获EIA(CE)测定法，双抗原夹心测定法等。

目前梅毒螺旋体免疫学检验方法主要有利用双抗原夹心法原理的酶联免疫法、化学发光法、金标层析法等。

TP双抗原夹心法原理是：在固相支持物上面包被第一抗原(即包被抗原)，加入待检标本，以合适的方式引入标记有特殊标记物的第二抗原(即标记抗原)，假如标本中存在TP抗体，则TP抗体跟上述二种抗原，形成“包被抗原-TP抗体-标记抗原”的三明治结构，然后通过标记抗原上的标记物将信号放大，得出最终的判定结果。

酶联免疫法及化学发光法法具有灵敏度高、准确率高的优点，但由于检测时间长、操作复杂、需要借助多台仪器、检测样本质量要求高，因此不适于即时检验(POCT)。

因此简单、快速、特异、灵敏度高的金标层析检测方法在梅毒螺旋体检测中被开发应用。

但应用金标层析方法要做到灵敏度高、特异性好，关键在于包被抗原的质量，包被抗原的性能对免疫检测的准确性有着决定性的影响。因此，在固相载体和包被方法限定的情况下，制备的包被抗原质量好坏是由抗原特点决定的，高质量的抗原需要具备的条件是：

(一)高吸附性，在免疫层析检测中，蛋白吸附于固相载体上，作为待测样本的捕获试剂，由于检测结果很大程度取决于捕获试剂在固相载体上良好的吸附效果，因此蛋白在固相载体上均一、良好的吸附对检测结果非常重要。而抗原自身的结构不同及带电荷不同均对吸附效果有较大影响。

(二)特异性好，抗原特异性很大程度依赖于其选择的抗原及表位，表达过程中是否正确折叠，以及抗原纯度，一旦表位选择不当或蛋白纯度达不到标准，便可导致检测结果的漏检或者假阳。

(三)稳定性好，稳定性不好的抗原往往是因为发生聚集或者发生降解导致活性降低；而稳定性好的抗原，无论是在缓冲体系中储存还是包被到固相载体上，在一定的极端条件，都不易发生活性的降低。

目前普遍存在的问题是很多抗原在包被到固相载体上以后，检测结果不理想，存在由于吸附效果差导致的检测线弥散现象，以及灵敏度低、特异性差，且稳定性实验不合格。