[发明专利]单质粒CRISPR-Cas9基因编辑工具及在异化金属还原菌中的应用

说明书

本发明涉及一种耗时短，效率高的可控消除单质粒CRISPR‑Cas9基因编辑工具，及其在异化金属还原菌中的多重基因编辑中的应用。本发明进一步涉及改善异化金属还原菌的胞外电子传递的方法，包括通过对同一菌株中Mtr传导复合物的形成，黄素的合成和NADH的生成中的关键基因实现多重基因编辑，得到胞外电子传递能力增强的菌株。

技术领域

本发明属于基因编辑领域，涉及一种单质粒可控消除CRISPR-Cas9基因编辑工具，及其在异化金属还原菌的基因编辑中的应用，以及增强异化金属还原菌的胞外电子传递的基因工程方法。

背景技术

异化金属还原菌(Dissimilatory Metal Reducing Bacteria,DMRB)是一类利用胞外金属氧化物进行呼吸并储存能量用于生长、代谢的微生物。DMRB经底物代谢产生的电子通常需要经过复杂的电子传递网络传递给胞外电子受体。除金属氧化物外，DMRB还可以将电子传递给金属离子、电极以及多种污染物。因此，它们在重金属(包括放射性核素)去除、生态修复和能源回收中具有巨大的应用价值。

S.oneidensis MR-1是DMRB中研究最为广泛的模式菌株之一，它通过Mtr(Metalreducing)呼吸途径中的细胞色素c(c-Cyts)复合物、胞外黄素电子穿梭体将胞内底物代谢产生的电子传递到胞外金属氧化物和污染物等电子受体。然而，由于野生型S.oneidensisMR-1的胞外电子传递(Extracellular Electron Transfer,EET)效率较低，限制了其在污染修复中的实际应用。

为了提高DMRB的EET能力，研究者已经开发出多种方法，如添加电子穿梭体和电子供体、优化黄素合成途径、促进NADH电子池再生、调节胞内第二信使Cyclic-di-GMP生成等。虽然这些方法已经取得了一些有价值的进展，但由于缺乏可用的基因组编辑工具，DRMB合成生物工程方面仍处于起步阶段。

目前，对于DMRB遗传改造的研究大多是基于质粒完成的，需要抗生素来维持其稳定性，这不仅增加了潜在的使用成本，也会引起抗生素抗性基因的水平转移。为满足环境应用的实际需求，DMRB的基因工程应在无抗生素标记的条件下完成。因而，不涉及质粒、不使用相关抗生素标记物的基因组原位编辑，在DMRB基因工程中有巨大的研究价值和应用潜力。

CRISPR-Cas9/Cpf1(成簇的有规则间隔短回文重复序列)已经成为一个强大的基因组编辑工具，极大的扩展了真核和原核生物的基因工程。

经典的II型CRISPR系统来源于酿脓链球菌，包含了一个由RNA引导的核酸内切酶(spCas9)及一个由crRNA和tracrRNA组成的sgRNA。spCas9核酸内切酶基于PAM序列(前间隔序列邻近基序，核酸序列形式为NGG)和N20序列(前间隔序列，为PAM序列5'端的20个碱基)靶向目标DNA序列，并在PAM序列相邻的位点切割DNA序列，启动胞内DNA修复程序。在DNA修复模板存在时，可促使同源重组的修复发生，进而实现任意基因组位点的精确编辑。

发明内容

发明人建立了一个工程化的高效可控消除单质粒基因编辑工具Easy-to-editCRISPR-Cas9，并利用其在S.oneidensis MR-1中进行了多基因编辑，获得了EET能力大幅提升的S.oneidensis MR-1菌株，实现了基因组范围内的工程设计和EET网络优化。

具体而言，例如，在该基因编辑工具中包含控制消除模块，编辑蛋白模块，目标操作模块和骨架模块，其中，

控制消除模块含有严谨调控型启动子和归巢核酸内切酶(例如，I-SceI核酸内切酶)编码基因的核心区域，分别位于核心区域两端的终止子，及分别位于两个终止子外端的归巢核酸内切酶识别序列，目标操作模块中，在上游同源臂与下游同源臂之间含有用于插入目标基因片段的位点。