[发明专利]单质粒CRISPR-Cas9基因编辑工具及在异化金属还原菌中的应用

权利要求书

1.基因编辑工具，其包含控制消除模块，编辑蛋白模块，目标操作模块和骨架模块，其中，

控制消除模块含有严谨调控型启动子和归巢核酸内切酶编码基因的核心区域，分别位于核心区域两端的终止子，及分别位于两个终止子外端的归巢核酸内切酶识别序列，

目标操作模块含有：插入位点上游同源臂(1kb UHR)；插入位点下游同源臂(1kb DHA)；gRNA(向导RNA，中间含有N20序列)；

骨架模块含有抗性基因表达盒(例如Km-R)，Mob，rep，终止序列(例如终止子茎环)，

目标操作模块中，在上游同源臂与下游同源臂之间含有用于插入目标基因片段的位点。

2.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其中，上述全部模块位于同一个载体中，所述编辑蛋白为Cas9蛋白，编辑蛋白模块含有Cas9蛋白表达盒和诱导启动子2(例如lacI-P_LAC)的表达盒。

3.根据权利要求1或2所述的基因编辑工具，其中，

在控制消除模块中，所述归巢核酸内切酶为归巢核酸内切酶I-SceI，所述I-SceI在所述严谨调控型启动子控制下，优选所述归巢核酸内切酶识别序列为SEQ ID No.1所示的序列，

所述严谨调控型启动子为诱导启动子1(例如araC-P_BAD启动子)，所述两个终止子分别为rrnb T2终止子和T1T2终止子。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的基因编辑工具，其中，所述可控消除基因编辑工具所编辑的细胞为革兰氏阴性菌，优选为异化金属还原菌。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的基因编辑工具，其中，

其中，控制消除模块来自pEM106质粒，工具蛋白模块来自pCAS9质粒(提供Cas9蛋白)和pICK2质粒(提供lacI-P_LAC诱导型启动子)，目标操作模块(包含目标sgRNA)，和骨架模块(来自pYYDT质粒)，优选地所述同一个载体为pFC001。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的基因编辑工具，其中，所述目标基因片段包含sgRNA，所述sgRNA的PAM序列优选为CGG和GGG，特别优选GGG，

所述目标基因片段优选在一个编辑框架中包含来源于多个(优选为1至3个)目标基因的片段，片段总长大小为约1kb～5kb之间，

优选在目标操作模块中，利用同一个启动子控制多个(例如，1至3个)表达盒。

7.可控消除外源工具载体的方法，其中，需要启动消除时，外源加入能够诱导所述严谨调控型启动子启动转录的诱导物(例如为阿拉伯糖)

所述外源工具载体为权利要求1～6中任一项所述的基因编辑工具。

8.基因编辑的方法，包括：

构建权利要求1～6中任一项所述的基因编辑工具，其含有目标基因片段，

将基因编辑工具导入目标细胞，

向目标细胞加入诱导物2，使控制基因编辑的诱导启动子2启动，

加入所述严谨调控型启动子的诱导物，使所述基因编辑工具从细胞中消除。

9.增强细胞电子传递能力的方法，其包括使用权利要求7或8中所述的方法对细胞色素c(c-Cyts)复合物合成相关基因(例如，cymA、mtrC、mtrA、mtrB、omcA)，黄素合成相关基因(例如ribA、ribB、ribC、ribD、ribE)，NADH合成基因(例如mdh、fdh)进行编辑，优选在编辑后消除工具载体。