[发明专利]一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法

说明书

本发明公开了一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法，其中，所述分离培养方法包括以下步骤：将鸡胚分离出软骨，将软骨组织剪碎后进行离心处理，弃上清液；在软骨组织碎片中加入胰蛋白酶进行消化处理，然后加入纯胎牛血清终止消化，离心后弃上清，再加入Ⅱ型胶原酶，水浴消化至组织块呈悬浊状；将上述悬浊液用细胞筛网过滤，将过滤后的滤液离心处理后弃去上清液，加入完全培养液，巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀重悬利用，得到软骨细胞；将分离的软骨细胞接种于细胞培养皿中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。所述鉴定方法采用免疫荧光鉴定软骨细胞标志蛋白ColⅡ。本发明首次建立了一种简单、可操作性强、重复性好的鸡软骨细胞分离培养及鉴定的方法。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法。

背景技术

软骨是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，其主要功能是通过分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖等保持关节软骨的功能，在正常生理条件下，软骨细胞的合成和分解代谢维持着动态平衡。而软骨细胞主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，无血液供应，细胞代谢缓慢，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱。因此，本发明研发出一种软骨细胞的培养方法，能够促进软骨细胞的增殖，提高软骨细胞的数量，用于解决现有技术中增殖速度较慢并伴随细胞退化的技术缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡原代软骨细胞分离培养及鉴定的方法，其首次建立了一种简单、可操作性强、重复性好的鸡软骨细胞分离培养及鉴定的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种鸡原代软骨细胞分离培养的方法，包括以下步骤：

(1)将鸡胚用75％酒精消毒后，用镊子敲碎气室端蛋壳，挑出整个鸡胚置于装有37℃的不含钙镁的PBS溶液的无菌培养皿中冲洗干净，然后分离腿部转移至干净的培养皿中，用镊子和手术剪剪去除软骨外的肌肉和骨膜，分离出软骨，将软骨组织剪碎后进行离心处理，弃上清液；

(2)在剪碎的软骨组织碎片中加入胰蛋白酶，在37℃水浴中进行消化处理，期间每隔10min轻摇离心管几次，然后加入纯胎牛血清终止消化，离心后弃上清，再加入Ⅱ型胶原酶，水浴消化至组织块呈悬浊状，期间每隔10min轻颠离心管几次；

(3)将上述悬浊液用细胞筛网过滤，将过滤后的滤液离心处理后弃去上清液，加入完全培养液，巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀重悬利用，得到软骨细胞；

(4)将分离的软骨细胞接种于细胞培养皿中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

优选地，所述步骤(1)中的鸡胚的胚龄为15天，离心转速为1000r/min，离心时间为5min。

优选地，所述步骤(2)中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25％，Ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.2％，消化时间均为30-40min。

优选地，所述步骤(3)中的细胞筛网的目数为200目，离心转速为800-1000r/min，离心时间为4-6min。

优选地，所述步骤(4)中的软骨细胞按照1×10⁴个/孔的密度铺板细胞培养皿。

一种鸡原代软骨细胞的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)鸡原代软骨细胞培养至第3天时，制作细胞爬片，将细胞接种至12孔板中，放入培养箱中；细胞爬片第二天弃去培养液，利用温育的PBS溶液冲洗两次，加入细胞固定液，细胞固定后，弃去固定液，利用PBS清洗3次；

(2)PBS清洗之后，加入封闭液，室温静置，弃去封闭液，PBS清洗3次，加一抗过夜；

(3)将一抗回收，PBS清洗3次，然后加入二抗，室温静置后弃去二抗，PBS清洗；