[发明专利]一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法

说明书

本申请涉及外泌体分离领域，更具体地说，它涉及一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法，具体包括如下步骤：S1、对人体皮肤成纤维细胞进行扩增培养；S2、换用无血清培养基，对扩增后的人体皮肤成纤维细胞进行饥饿培养，饥饿培养过程中切换至无氧状态，并通入少量一氧化氮对人体皮肤成纤维细胞进行刺激；S3、取上清液，并通过滤膜过滤除去细胞和细胞碎片；S4、通过超速离心法，分离上清液中的外泌体。在本申请中，通过一氧化氮刺激人体皮肤成纤维细胞，使之可以更好地分泌外泌体，进而提高了外泌体的产量。

技术领域

本申请涉及外泌体分离领域，更具体地说，它涉及一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法。

背景技术

成纤维细胞是细胞外基质沉积和重塑的主要间充质细胞类型。人体皮肤成纤维细胞产生的外泌体，对皮肤皱纹或皮肤缺损的治疗，有着重要的作用。

人体皮肤成纤维细胞的外泌体一般通过对人体皮肤成纤维细胞进行培养至一定密度后，换用无血清培养基进行饥饿培养，随后取出上清液，通过超速离心法或其他方法，分离得到其中的外泌体。

在实际使用过程中，外泌体的用量较大，而采用上述方式制得的外泌体产量仍然较低。

发明内容

为了提高人体皮肤成纤维细胞的外泌体产量，本申请提供一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法

本申请提供的一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法采用如下的技术方案：

一种人体皮肤成纤维细胞外泌体制备分离方法，具体包括如下步骤：

S1、对人体皮肤成纤维细胞进行扩增培养；

S2、换用无血清培养基，对扩增后的人体皮肤成纤维细胞进行饥饿培养，饥饿培养过程中切换至无氧状态，并通入少量一氧化氮对人体皮肤成纤维细胞进行刺激；

S3、取上清液，并通过滤膜过滤除去细胞和细胞碎片；

S4、通过超速离心法，分离上清液中的外泌体。

在上述技术方案中，在饥饿培养的过程中，在无氧状态下可以抑制细胞本身的分裂，而通过一氧化氮的刺激，细胞可以产生更多的外泌体。经过实际试验证明，上述方法的确可以提高细胞外泌体产生的速率，同时外泌体的平均粒径基本保持不变，是一种较好的提高外泌体产量的方式。无氧条件一方面抑制细胞分裂，同时也避免的一氧化氮本身被氧化，减少对细胞本身的损伤。

可选的，在步骤S1中，人体皮肤成纤维细胞采用悬浮培养。

相较于贴壁培养，悬浮培养的人体皮肤成纤维细胞中，外泌体中所含I型胶原蛋白较高，因此其最终得到的外泌体对于皮肤的治疗效果也更好。另外，悬浮培养也有助于获得更大量的外泌体。

可选的，在步骤S2中，饥饿培养的时间为20～30h。

在上述技术方案中，采取较短的饥饿培养时间，从而减少因细胞凋亡造成的外泌体产量降低和纯度降低。由于在本申请中，通过一氧化氮刺激，提高了外泌体的产量和分泌速率，因此采用较短的培养时间也可以获得较高的外泌体产量。

可选的，在步骤S2中，饥饿培养至8～15h后，将人体皮肤成纤维细胞转至无氧培养箱中，培养2～3h后，通入一氧化氮，继续培养10～15h，随后停止通入二氧化氮，并继续培养至结束。

在上述技术方案中，在饥饿培养的过程中，先进行一段时间的有氧培养，使细胞正常增殖一段时间，并生产一定量的外泌体，随后转化为无氧状态，并在无氧状态系下保留2～3h，供细胞将剩余氧气消耗完毕，从而减少一氧化氮氧化成酸的可能性。同时，在上述过程中，细胞开始逐渐减慢生长，在一氧化氮刺激下，可以分泌更多的外泌体，最终提高了外泌体的产量。

可选的，在无氧培养箱中，一氧化氮的分压占总分压的0.01～0.1％。