[发明专利]BTV1保护性表位多肽、其特异性识别单克隆抗体、抗体分泌细胞及其应用

说明书

本发明公开了一种BTV1保护性表位多肽、其特异性识别单克隆抗体、抗体分泌细胞及其应用，旨在解决BTV血清型的检测诊断及BTV预防和治疗试剂或药物不完善、不全面的技术问题。本发明鉴定得到一种全新的BTV1 VP2蛋白的线性B细胞表位：^296‑KEPAD^‑300，并诱导制得能特异性识别该表位的单克隆抗体。该线性B细胞表位丰富了BTV1 VP2蛋白的免疫学功能，为后续研究VP2蛋白的结构特性以及抗原特性提供参考，可应用于抗病毒药物、防疫疫苗等的研发。

技术领域

本发明主要涉及分子生物学、病毒学及免疫学领域，具体涉及BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位肽、其特异性识别单克隆抗体、抗体分泌细胞，及其在制备相关BTV1诊断或预防试剂中的应用。

背景技术

蓝舌病（Bluetongue, BT）是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的一种可经由媒介昆虫如库蠓、伊蚊等传播的非接触性传染病。BTV主要感染包括牛、羊在内的多种反刍哺乳动物，感染后能够造成较高的发病率、死亡率和严重的临床症状，严重危害畜牧业的经济发展，对全球经济产生重大影响。因此，该病是世界动物卫生组织（OIE）规定的需要上报的一种多种动物共患疫病，被我国列为一类动物传染病。

BTV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)，其基因组包含了10段双链RNA片段，可编码7种结构蛋白和4种非结构蛋白。目前，共有27种血清型的BTV被发现，然而研究表明，不同血清型之间的中和抗体并没有交叉保护性。我国于1979 年在云南首次出现 BT，其中BTV1和BTV16在我国流行最广。由BTV L2基因编码VP2蛋白是BTV中可变程度最高的蛋白，因此也是决定血清型的主要因素。此外，VP2蛋白位于病毒粒子的最外层，主要与环境介质相互作用；同时，介导病毒的吸附和进入，包含可被中和的血凝抑制（HI）抗体识别的血清型特异性表位，可以诱导产生中和抗体。因此，针对VP2蛋白单克隆抗体的制备及其B细胞表位的研究将会为BTV相关诊断、预防和治疗试剂或药物的研究及应用提供重要技术支持，并为蛋白结构解析及表位疫苗制备奠定基础。

发明内容

基于现有研究的不足和现实需要，本发明旨在提供一种BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位，并诱导产生特异性中和抗体，以建立、完善BTV血清型的鉴定方法，并为相关诊断、预防和治疗BTV试剂或药物的制备研究提供技术支撑。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

经大量的试验研究，鉴定得到一种BTV1 VP2线性B细胞表位：^296-KEPAD^-300。

本发明基于Bac to Bac双启动子杆状病毒表达系统，成功构建pFastBac^TMDual-VP2重组表达载体，在Sf21昆虫细胞中进行重组BTV1 VP2蛋白的表达，经镍离子亲和层析法对表达后的VP2蛋白进行纯化并获得了高纯度、具有良好生物活性和免疫原性的目的蛋白。

并进一步利用纯化所得BTV1 VP2重组蛋白免疫Balb/c小鼠，间接ELISA方法检测免疫后小鼠血清效价水平，取血清效价水平较高的小鼠进行细胞融合。利用大肠杆菌表达系统所得的原核VP2重组蛋白作为检测抗原，经间接ELISA方法对融合后产生的杂交瘤细胞株进行筛选检测，最终筛选得到三株能稳定分泌抗BTV1 VP2蛋白mAbs的杂交瘤细胞株，并将其分泌的单克隆抗体命名为17E9C6、17E9C8和17E9H12。

经间接免疫荧光试验（IFA）鉴定，三株单克隆抗体可与BTV1 VP2蛋白发生特异性反应；而Dot-ELISA试验结果表明此三株单克隆抗体也可与BTV1灭活病毒发生特异性反应。