[发明专利]一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法

说明书

本发明公开了一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，该方法包含：(1)农杆菌侵染液的制备：采用携带pHZM27质粒的根癌土壤农杆菌EHA105菌株；(2)根癌农杆菌介导的荞麦浸花转化：先将已经开放或受精的花朵移走，将荞麦的花序浸泡在农杆菌侵染液中，浸泡后的花序用纸袋包裹以保持湿度，置于室温暗培养；(3)对转化后荞麦筛选：在荞麦花序全部浸染后第3～5天对植物进行授粉，待种子成熟，收取转化种子；将转化种子播种，待萌发后进行Basta抗性筛选；对抗性植株进行PCR鉴定和荧光显微镜观察。本发明的转化方法将基因转化到荞麦中，不需要进行组织培养，为荞麦的分子育种、种质资源创制及品种改良奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种高效遗传转化方法，具体涉及一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法。

背景技术

通过基因工程技术改变植物的遗传性状是成熟的技术手段。在植物基因工程中，科研人员多采用叶片、叶柄、叶芽等为侵染对象，建立遗传转化体系，应用于植物上的基因导入法主要有农杆菌介导法、基因枪法和电击法。

荞麦是传统的杂粮作物，具有生长期短、抗逆性强、适应性广泛等的特点，更重要的是荞麦属蓼科植物，是一种药食同用的作物，其种子中含有大量膳食纤维和微量元素，以及丰富的生物类黄酮、多酚活性物质，不仅参与人体脂代谢，还具有保护视力、降血脂、降血压以及减脂等保健功能。因此，基于荞麦重要的食用和药用价值，目前已成为国内外研究的热点，开发有效的遗传转化体系将促进其基因功能的研究。

然而，在荞麦中，基于植物细胞的全能性原理，中国专利CN 109349108 A采用组培苗的子叶和下胚轴切段作为外植体进行转化，中国专利CN 102352378 A选取叶龄2～30d、生长状况良好的苦荞麦无菌苗叶片作为外植体进行培养基预培养后进行农杆菌菌液侵染培养。但这些方法均存在费时、工作量大或转化效率低等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，不需要进行组织培养，消除了组织培养中发生不必要的微生物污染、体细胞突变或体细胞无性系变异的风险，为荞麦的分子育种、种质资源创制及品种改良奠定基础。

为了达到上述目的，本发明提供了一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，该方法包含：

(1)农杆菌侵染液的制备：

将活化的携带pHZM27质粒的根癌土壤农杆菌EHA105菌株接种到LB液体培养基中，该LB液体培养基中含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平，28℃过夜摇菌，接种至新的LB液体培养基中，重复过夜摇菌，直至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8；

将所述菌液离心，弃去上清液，剩下的加入至侵染液中，重悬细菌，以获得农杆菌侵染液；其中，所述侵染液包含：20×MS major salts stock、100×MS minor salt stock、Sucrose、BAP、乙酰丁香酮、Silwet L-77和水；所述20×MS major salts stock包含：KNO₃、NH₄NO₃、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂和水；所述100×MS minor salt stock包含：硼酸、MnSO₄·H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Na₂MO₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O和水；

(2)根癌农杆菌介导的荞麦浸花转化：

在进行转化之前，先将已经开放或受精的花朵移走，然后将荞麦的花序浸泡在农杆菌侵染液中，浸泡后的花序进行标记，并用纸袋包裹以保持湿度，置于室温暗培养；