[发明专利]一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，该方法包含：

(1)农杆菌侵染液的制备：

将活化的携带pHZM27质粒的根癌土壤农杆菌EHA105菌株接种到LB液体培养基中，该LB液体培养基中含有50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平，28℃过夜摇菌，接种至新的LB液体培养基中，重复过夜摇菌，直至菌液OD₆₀₀为0.6～0.8；

将所述菌液离心，弃去上清液，剩下的加入至侵染液中，重悬细菌，以获得农杆菌侵染液；其中，所述侵染液包含：20×MS major salts stock、100×MS minor salt stock、Sucrose、BAP、乙酰丁香酮、Silwet L-77和水；所述20×MS major salts stock包含：KNO₃、NH₄NO₃、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂和水；所述100×MS minor salt stock包含：硼酸、MnSO₄·H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Na₂MO₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O和水；

(2)根癌农杆菌介导的荞麦浸花转化：

在进行转化之前，先将已经开放或受精的花朵移走，然后将荞麦的花序浸泡在农杆菌侵染液中，浸泡后的花序进行标记，并用纸袋包裹以保持湿度，置于室温暗培养；

待暗培养24h后，去掉纸袋于室外环境下培养，每隔2天重复农杆菌侵染液浸泡程序3次；

待转化后，荞麦会继续发育出新的花序和花，进行第二轮转化，或者及时去除这些未转化的花序；

(3)对转化后荞麦筛选

在荞麦花序全部浸染后的第3～5天对植物进行授粉，待种子成熟，收取T₀转化种子；

将收取的T₀转化种子浸种，播种于营养土中，待萌发4～5天后，喷洒Basta溶液进行筛选，将Basta溶液喷洒到萌发幼苗的子叶上，转化苗对Basta表现出抗性，转化后的幼苗能够存活；

对抗性植株进行PCR鉴定和荧光显微镜观察：提取Basta抗性植株叶片基因组DNA，采用的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，以pHZM27质粒DNA为阳性对照，无核酸酶水为阴性对照，进行PCR扩增，扩增出609bp的PCR条带，且利用荧光显微镜观察到转化植物表皮细胞中产生荧光基点。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，所述荞麦的品种为‘北早生’，在开花期对健康强壮的植株进行转化。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，所述侵染液包含：25mL 20×MS major salts stock、5mL 100×MS minorsalt stock、30g Sucrose、10μL BAP、100μL乙酰丁香酮和1mLSilwet L-77，用水定容至1L。

4.根据权利要求3所述的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，所述BAP的配制，为：将200mg 6-苄氨基腺嘌呤溶解于10mL 1M/LNaOH中，加入90mL无菌水。

5.根据权利要求3所述的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，所述乙酰丁香酮为，浓度为40mg/mL的乙酰丁香酮的二甲基亚砜溶液。

6.根据权利要求3所述的农杆菌介导荞麦的高效遗传转化方法，其特征在于，所述20×MS major salts stock中，KNO₃、NH₄NO₃、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂和水的用量比为38.0g：33.0g：3.4g：7.4g：6.64g：1L；所述100×MS minor salt stock中，硼酸、MnSO₄·H₂O、ZnSO₄·7H₂O、Na₂MO₄·2H₂O、CoCl₂·6H₂O和水的质量比为310mg：845mg：430mg：12.5mg：1.25mg：500mL。