[发明专利]柚籽多糖提取工艺

权利要求书

1.沙田柚籽多糖提取工艺，其特征在于，包括：将沙田柚籽粒烘干后粉碎得到柚籽粉，柚籽粉经脱脂处理后采用水提结合酶法，同时辅以超声提取籽多糖，然后得到的粗多糖依次经除蛋白和脱盐处理，最后通过离子交换层析和分子筛层析得到纯化的柚籽多糖；

具体地，包括以下步骤：

1)样品制备：将沙田柚籽粒筛选除杂，于50℃烘干至恒重，然后粉碎过20目筛，得到柚籽粉；

2)脱脂处理：取规格为33mm×80m的滤纸筒，将10.00g柚籽粉加入到上述滤纸筒中，将金属制的滤筒接头安装到滤纸筒上，安装完毕后将滤纸筒扣在样品杆的磁铁环上；量取100mL正己烷于铝制浸提杯中，将浸提杯放置到持杯器上，将浸提杯移入2055索斯特克-阿万提浸提装置中，于160℃恒温浸提22min，正己烷经冷凝后淋洗41.66min，回收溶剂10min；浸提结束后，将固体残渣和滤纸筒置于热风干燥箱中干燥至恒重；然后粉碎过20目筛，得到柚籽粉末；

3)多糖提取：将1.00g柚籽粉末置于100mL烧杯中，按料液比1:25加入20％的纤维素酶溶液，调pH至5.0，然后于55℃水浴锅中提取30min，接着在超声功率200w，55℃条件下超声提取25min；然后于90℃水浴锅中浸提30min，冷却至室温后，3000rpm离心10min，取上清液；向上清液中加入上清液体积3倍的95％乙醇，沉淀过夜；然后4000rpm离心10min，收集沉淀，经真空冷冻干燥得到粗多糖；

4)除蛋白：用Sevag法去除粗多糖中的蛋白质，具体为：用水配制成1.00％的粗多糖溶液，向粗多糖溶液中加入粗多糖溶液1/3体积的Sevag试剂，剧烈震荡30min后静置2h，然后4000rpm离心10min，取上清液，重复Sevag法除蛋白，直至无中间蛋白层出现为止；所用Sevag试剂中氯仿和正丁醇的体积比为4:1；

5)透析脱盐：除蛋白后的籽多糖溶液经减压浓缩，装入透析袋内，在磁力搅拌器作用下，用去离子水在4℃条件下透析8h，每8h换一次水，直至透析后的水电导率与去离子水的电导率一致；透析结束后进行冷冻干燥，得到籽多糖中间品I；所用透析袋的规格为1000Da；

6)阴离子交换柱层析：将籽多糖中间品I用水配制成5mg/mL的多糖溶液，经0.22μm滤膜过滤后上DEAE-Sepharose Fast Flow柱，柱规格为Φ1.5×40cm，上样量10mL，流速为2.0mL/min，用自动收集器收集洗脱液，每10mL收集一管，先用一级水进行洗脱，直到洗脱液没有多糖检出为止；然后依次用0.1M、0.3M和0.5M的氯化钠溶液对层析柱进行梯度洗脱，每个浓度洗脱至洗脱液没有多糖检出为止；收集0.3M氯化钠溶液对应的洗脱液，合并多糖单一峰部分，减压浓缩，真空冷冻干燥，得到籽多糖中间品II；

7)葡聚糖凝胶柱层析：将20mg籽多糖中间品II溶解在4mL蒸馏水中，6000rpm离心10min，上清液经0.45μm滤膜过滤后加至Sephadex G100柱，用蒸馏水洗脱凝胶柱，控制流速为0.2mL/min，每管收集2mL，用苯酚-硫酸法对其多糖含量进行检测；合并属于同一洗脱峰的洗脱液，浓缩后冻干，即得纯化的柚籽多糖。