[发明专利]一种提高间充质干细胞培养液中碱性成纤维细胞生长因子含量的方法

说明书

本发明公开了一种提高间充质干细胞培养液中碱性成纤维细胞生长因子含量的方法，该方法在细胞扩增至融合度70%‑80%时，使用注射用生理盐水更换培养液，12小时后，收集细胞上清待用，将细胞使用胰蛋白酶进行消化，收集细胞；将收集的细胞与细胞上清混合，进行低速离心，离心转速为500转‑8000转/分钟，离心结束后收集上清，并进行过滤，去除细胞碎屑残留。本发明的提高间充质干细胞培养液中碱性成纤维细胞生长因子含量的方法通过将细胞与培养上清共同低速离心，从而使得干细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的含量明显提高；该方法无需使用高速离心机，且细胞不用裂解，能够减少成本，减少繁琐步骤。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，具体来说，涉及一种提高间充质干细胞培养液中碱性成纤维细胞生长因子含量的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞。MSC具有免疫调控、促进造血干细胞归巢、能够修复损伤或病变的组织器官、具备多向分化潜能等功能，因此具有广泛的应用前景。

脐带间充质干细胞(UCMSCs)是存在于脐带华通氏胶中的一种成纤维样细胞，该细胞具有自我更新、增殖和多向分化潜能。它具有明显的优势：(1)成本较低；(2)来源丰富；(3)是一种较为原始的干细胞，具有极强的可塑性；(4)与骨髓间充质干细胞(bonemesenchymal stem cells，BMSCs)相比，具有更强的扩增能力；(5)无致瘤性和低免疫原性；(6)与BMSCs相比，不会随着传代次数增加而导致增殖能力和分化能力下降(曲宏文,张越林.脐带间充质干细胞在疾病中应用的研究进展[J].世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊)2020,20(34):74-76,79.DOI:10.3969/j.issn.1671-3141.2020.34.032)。

随着对间充质干细胞研究的不断深入，其作用机理也越来越清晰明确，主要有3方面：l、间充质干细胞旁分泌作用；2、间充质干细胞替代或修复死亡或受损的组织细胞；3、细胞直接接触，调控细胞。越来越多的研究表明，间充质干细胞旁分泌作用在其发挥治疗效果中起主要作用。脐带间充质干细胞在培养过程中可分泌多种细胞因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、神经生长因子(NGF)、白介素6(IL-6)等。大量研究表明间充质干细胞所分泌的因子能在一定程度上促进皮肤细胞生长、改善细胞生长微环境、促进伤口愈合、延缓衰老、改善皮肤生长状态等作用，因此间充质干细胞受到了人们的重视，是目前研究较多的一种干细胞。

中国专利CN 107320716 A公开了碱性成纤维细胞生长因子囊泡及其制备方法，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一类具有多种生理功能的生长因子，主要存在于表皮基底的角质形成细胞内，是重要的促细胞有丝分裂因子和血管生成因子，对来源于外胚层和中胚层的细胞，如上皮细袍、成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞、真皮细胞、血管内皮细胞等具有促进修复和再生作用，能促进细胞增殖、生长、分化，改善细胞生活微环境，促进受损神经再生及血管、肌肉、皮肤等修复，减少紫外线辐射对皮肤造成的损害。同时碱性成纤维细胞生长因子也促神经细胞营养和再生因子，能增加皮肤自身的免疫功能，改善循环，促进皮肤新陈代谢，修复受损皮肤。

中国专利CN 108309822 A公开了一种人脐带间充质干细胞旁分泌因子冻干粉的制备方法，现有技术是用普通培养瓶培养间充质干细胞，达到一定天数后收集细胞培养上清液，并对上清液进行过滤得到细胞旁分泌因子，该方法得到的间充质干细胞旁分泌因子含量低。

目前提高碱性成纤维细胞生长因子的方法有高速离心法、超滤法、细胞裂解法等，其中高速离心法，是用高速离心机离心，将浓度提高，对硬件要求很高，所需费用较高；而超滤法，是将液体浓缩，提高其浓度，并未提高整体因子的含量，且成本较高。细胞裂解法，需对细胞进行裂解，方法较为繁琐。