[发明专利]一种诱变菌种以及从植物甾醇制备胆酸类化合物的方法

说明书

本发明提供了一种从植物甾醇制备4‑胆烯酸‑3‑酮的方法，将保藏编号为CCTCC M2020987的诱变菌种经培养后接种至转化培养基，对式Ⅰ所示植物甾醇进行发酵转化，得到式Ⅱ所示4‑胆烯酸‑3‑酮。本发明提供了一种新的以植物甾醇为原料，通过生物发酵与化学合成相结合的手段，制备4‑胆烯酸‑3‑酮、石胆酸、鹅去氧胆酸、7‑酮石胆酸的方法，该方法未使用动物源提取，可以以工业废水废渣为原料，绿色环保；操作简单，收率高，异构体杂质少，有机溶剂使用量少；通过本发明制备胆酸类化合物，反应试剂简单易得，反应条件温和，反应收率高，适合工业化大生产。

技术领域

本发明涉及化学制药技术领域，尤其涉及一种诱变菌种以及从植物甾醇制备胆酸类化合物的方法，具体涉及以植物甾醇为原料通过生物发酵与化学合成相结合的方式制备胆酸类化合物的方法。

背景技术

胆汁酸是胆汁的重要成分，在脂肪代谢中起着重要作用。胆汁酸主要存在于肠肝循环系统并通过再循环起一定的保护作用。近年来，胆酸及其衍生物被发现了在治疗和预防疾病方面有较大作用，因为很多胆酸及其衍生物是法尼醇X受体激动剂，因此会参与调节法尼醇X受体介导的病症，比如肝脏、肺部、肾脏、心脏等疾病或者糖代谢、脂肪代谢、胰岛素代谢等生物过程。

目前胆汁酸主要从生物体提取分离出来，近年来，人们也通过合成研究，实现了胆汁酸之间的相互转变，比如从猪去氧胆酸合成石胆酸(LCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)和熊去氧胆酸(UDCA)，从胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸和去氧胆酸等合成石胆酸，从鹅去氧胆酸合成7-酮石胆酸(7-KLCA)进一步合成熊去氧胆酸或者奥贝胆酸等，一方面由于提取的胆酸类化合物来源毕竟有限，另一方面从生物体提取的胆酸类化合物可能含有不可知的污染物，人们也开始研究以植物原料为来源合成胆酸类化合物，但始终由于技术原因还处于小规模研发阶段。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种诱变菌种以及从植物甾醇制备胆酸类化合物的方法，该方法反应条件温和，反应收率高，适合工业化大生产。

为达到上述目的，本发明提供了一种分支杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805的诱变菌种，保藏编号为CCTCC M2020987。

该菌种由分支杆菌NRRL B-3805为出发菌种，经诱变得到。

上述原始菌种的来源为美国农业研究菌种保藏中心。

本发明提供了用于生产4-胆烯酸-3-酮的分支杆菌诱变菌种的诱变方法，包括以下步骤：

以分支杆菌NRRL B-3805为出发菌种，经过斜面培养和二级种子培养，收集菌体制备菌悬液，加入亚硝基胍进行诱变处理，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上，挑选单菌落进行植物甾醇发酵，检测4-胆烯酸-3-酮的产量，得到能产生4-胆烯酸-3-酮的目标诱变菌种，并分离保存菌株。

本发明优选的，所述斜面培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L；葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L；琼脂粉20g/L,pH＝7.5。

本发明优选的，所述种子培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L；葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L，pH＝7.5。

本发明优选的，所述固体培养基的配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L，葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L；琼脂粉20g/L，pH＝7.5。

所述诱变处理的时间优选为30min。