[发明专利]一种L-谷氨酸生产菌株及其构建方法与应用

权利要求书

1.L-谷氨酸生产菌株在发酵生产L-谷氨酸方面的应用，所述L-谷氨酸生产菌株是由下述方法得到的：敲除谷氨酸棒杆菌GDK-9基因组中的cgl2509基因，获得基因敲除菌株谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509，其中所述基因cgl2509序列为SEQ ID NO.1，具体发酵生产方法如下：

（1）菌株活化：将谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509从-80℃冰箱中取出，接种于斜面培养基上，传代两次，得到活化菌株；所述斜面培养基为：蛋白胨5 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉4g/L，玉米浆干粉25 mL/L，KH₂PO₄1 g/L，MgSO₄0.2 g/L，NaCl1 g/L，琼脂粉25 g/L，甲硫氨酸0.2 g/L，pH=6.8-7.0；

（2）制备种子液：用无菌水将斜面上的菌株洗脱，全部接种到含有种子培养基的种子罐中，发酵控制条件：温度控制在34 ℃，溶氧控制在30-50%，pH通过氨水控制在6.8-7.2；所述种子培养基为：葡萄糖35 g/L，玉米浆干粉15 g/L，豆浓22 ml/L，K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，MgSO₄·7H₂O 1 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，苏氨酸 1 g/L，丁二酸1 g/L，FeSO₄·7H₂O 5 mg/L，MnSO₄·H₂O 5 mg/L，VB₁ 0.5 mg/L，VB₃ 0.5 mg/L，VB₅ 0.5 mg/L，VB₁₂ 0.5 mg/L，氯化胆碱0.1 g/L，甜菜碱0.1 g/L，D-谷氨酸 2g/L；

（3）发酵：当种子液的OD₆₀₀达到20时，将种子液按20%的接种量接种到含有发酵培养基的发酵罐中，当发酵罐中的OD₆₀₀值达到20时开始流加玉米浆，流加玉米浆浓度为0.5-1.5g/L；发酵控制条件：初始温度控制在34℃，每4 h升温0.5℃，升温至37℃停止；溶氧通过转速和通风控制在30-50%；pH通过流加氨水控制在6.8-7.2；所述发酵培养基：MnSO₄·H₂O 10mg/L，MgSO₄·7H₂O 1.8 g/L，FeSO₄·7H₂O 5 mg/L，Na₂HPO₄·12H₂O 3.5 g/L，KCl 1.8 g/L，VB₁ 0.5 mg/L，VB₃ 0.5 mg/L，VB₅ 0.5 mg/L，VB₁₂ 0.5 mg/L，糖蜜1.2 g/L，玉米浆干粉2.5g/L，豆粕水解液15 ml/L，氯化胆碱0.1 g/L，甜菜碱0.1 g/L，D-谷氨酸 2g/L。

2.根据权利要求1所述的L-谷氨酸生产菌株在发酵生产L-谷氨酸方面的应用，其特征在于：所述L-谷氨酸生产菌株的构建方法的具体步骤如下：

（1）同源性片段cgl2509F和cgl2509R的制备：以谷氨酸棒杆菌GDK-9菌体的DNA为模板，使用扩增引物cgl2509F F1和cgl2509F F2进行PCR扩增 cgl2509F片段，使用扩增引物cgl2509R R1和cgl2509R R2进行PCR扩增 cgl2509R片段，其中cgl2509F F1和cgl2509R R2的5’端分别加入限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的线性载体同源序列，其中，限制性内切酶XbaⅠ线性载体同源序列为TCTAGA，限制性内切酶HindⅢ的线性载体同源序列为AAGCTT，同时对扩增后的cgl2509F片段和cgl2509R片段进行回收；所述引物cgl2509F F1、cgl2509F F2、cgl2509R R1和cgl2509R R2的序列依次为序列表SEQ ID NO.2-5所示序列；

（2）重叠PCR：用扩增出的上下游同源臂作为模板，以cgl2509F F1和cgl2509R R2作为引物，进行重叠PCR，获得cgl2509中间缺失的重叠片段∆cgl2509；

（3）重组质粒的构建：对质粒p K18mobsac B用XbaⅠ和HindⅢ进行双酶切线性化，所述质粒p K18mobsac B序列为序列表SEQ ID NO.6所示序列，然后将重叠片段∆cgl2509与线性化后的pK18mobsacB进行连接，构成重组质粒pK18mobsac B∆cgl2509，然后将重组质粒化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05μg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落；摇管培养，并提取出重组质粒pK18mobsacb∆cgl2509；

（4）将提出的重组质粒pK18mobsacb∆cgl2509电转到谷氨酸棒杆菌GDK-9的感受态菌株中并涂布于0.01μg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时；挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段长度是1700-1750为发生单交换的单菌落，同时将挑选出的菌株用体积分数为20%的甘油保藏；

（5）将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养，分别在2h、4h、6h接50μL培养液涂布于含有10%蔗糖的BHI平板；挑选单菌落进行pcr，并将单菌落对点于含有10%蔗糖的BHI平板和含0.01μg/mL浓度的卡那霉素抗性的BHI平板，挑选能在含有10%蔗糖的BHI平板上生长而不能在卡那霉素抗性的BHI平板上生长的单菌落，对其进行琼脂糖凝胶电泳检验，PCR片段长度是1300为发生双交换的单菌落，同时将挑选出的菌株用体积分数为20%的甘油保藏，此时获得的菌株即为谷氨酸棒杆菌GDK-9∆cgl2509。