[发明专利]一种中通量单细胞拷贝数文库构建的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种中通量单细胞拷贝数文库构建和测序的方法，所述方法包括：分选单细胞，对各个单细胞进行独立细胞裂解、Tn5转座酶系统插入基因组DNA同时并进行单细胞特异性全基因组条码精准标记，随后进行多样品混合、在单一试管内进行多样品测序文库构建，并进行后续测序，测序后根据单细胞样品条码精准解码获得鉴定对应细胞的数据和分析。本发明核心是含有样品特异性的核苷酸条码寡核苷酸的Tn5转座酶对单细胞样品DNA进行片段化同时加入识别序列，随后早期进行直接混合多个样品，从而无需预扩增、实现早期单试管混合样品操作、而且文库与通用测序系统兼容，实现高效的基因组测序文库构建和测序。

技术领域

本发明涉及单细胞测序领域，具体涉及一种中通量单细胞拷贝数文库构建的方法及其应用。

背景技术

随着人类基础医学的蓬勃发展，二代测序平台的越来越成熟。二代测序包括基因组测序、转录组测序、表观组测序等。二代测序最主要的前提是是需要在靶序列(目标序列)的2端加上特别的测序接头，也就是所谓的测序文库制备。近年来单细胞测序技术飞速发展，在生殖、发育、衰老及癌症研究等领域取得了重要成果，但昂贵的实验费用和高质量的文库制备是矗立在研究人员面前关键障碍。因此高通量、低成本的高质量单细胞文库制备技术和相应的测序策略有广阔的前景。

但是，令人遗憾的是，即使是目前为止较成熟的高通量单细胞转录组测序技术，价格成本也是十分昂贵，使用基于drop-seq技术的10×genomics chronium平台也需要高达数万元/每个样品(约3000-6000个单细胞)，而且除此以外还有诸多的限制。

传统的单细胞基因组测序技术与群体细胞基因组测序技术在文库制备上是基本上一致，都需要经过片段打断，加接头，聚合酶链式反应(PCR)等步骤。但不同的是，单细胞测序为了达至足够的起始质量以便可以使用超声波或酶切的方法打断基因组核酸序列，普遍都需要使用特殊的单细胞基因组扩增方法进行预扩增，例如MDA、MALBAC或基于DOP-PCR的扩增方法。但无论怎样，都使得单细胞基因组测序的成本都提升。因此单细胞基因组测序技术由于各种限制，在文库制备上常常耗时、耗力、耗费；从单个细胞的获取到真正测序文库制备完毕，所涉及步骤繁琐，需要大量的试剂耗材，每一个单细胞基因组测序文库构建费用远远大于转录组测序。

单细胞基因组测序主要包括拷贝数变异(CNV)测序，及单核苷酸变异(SNV)测序(SNV本专利不涉)。低通量(通常是单个细胞分别独立全程建库)单细胞基因组测序费用昂贵，费时、费力，近年出现的高通量的单细胞基因组测序在大大提高了通量效率，固然在一些研究领域如肿瘤研究具有巨大潜在价值，但是，不仅其仍然昂贵的费用让人望而却步，在某些重要的临床检测应用上有着诸多实际的限制。1、这些临床样品细胞数量并不多。以植入前产前诊断(PGT)为例，只需要滋养层8-13个细胞即可，或者3-5个细胞。以循环肿瘤细胞(CTC)为例，在病人常规的2ml血中，一般只存在3-20个，甚至无法纯化出CTC，通量一般续保数十至数百样品。2、无法进行精准的对指定单个细胞的预先标记。目前的高通量技术中，存在条码序列的高通量单细胞建库技术无法在文库构建时精准定点地对单个细胞进行标记；只用于生信分析后期将数据归属于不同的单细胞数据，并不能精准鉴定某一个数据属于哪一个预先指定的单细胞。3、价格昂贵，费用包括在建库和测序2方面，scCNV测序的费用主要在建库方面，scSNV测序在建库和测序2方面都更加昂贵(本专利不涉及scCNV创新)。

目前尚没有理想的技术可以在单细胞层面实现中(高)通量单细胞拷贝数文库构建方法，能精准标记每个指定细胞，同时快速、经济、高效，并适合于临床实用性的中(高)通量的scCNV(MT-scCNV)技术。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供基于Tn5转座酶特异性引物的一种低成本高效率中通量单细胞拷贝数测序方法MT-scCNV-seq(CNV：Copy NumberVariation染色体或亚染色体区域或DNA片段的拷贝数变异。sc：Single cell单细胞。MT:Medium throughput中通量)。