[发明专利]一种重组类人胶原蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种重组类人胶原蛋白(rhLEC)及其制备方法和应用，所述蛋白具有温敏特性，为类人源胶原蛋白(rhCOL)和弹性蛋白各自不同的功能域结合获得的融合蛋白，包含弹性蛋白五肽重复序列Val‑Pro‑Gly‑Xaa‑Gly(VPGXG)n和类人胶原蛋白肽。所述融合蛋白可利用可逆相变循环法纯化，实现融合蛋白的快速粗提及初步纯化，减少工艺流程和纯化成本。本发明的rhLEC相比于类人源胶原蛋白，显著改善了其稳定性。rhLEC显著促进了细胞粘附和创伤修复，促进毛细血管生成和组织胶原新生。可作为组织工程基质材料，细胞培养的活性添加剂，以及化妆品原料，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种重组类人胶原蛋白(rhLEC)及其制备方法和应用。

背景技术

重组类人胶原蛋白肽是一种生物性高分子物质，具有水溶性强、生物活性高、无免疫源性低和生物相容性高的优点。其常用于组织工程和创面敷料，有效提高皮肤再生速度，缩短创伤愈合时间。中国专利CN104098701A公开了一种重组类人胶原蛋白融合蛋白及其制备方法与应用，该融合蛋白热稳定性较差，常温下容易降解，保存难度较大，且不易纯化。因此亟需开发稳定性好、易纯化的重组类人胶原融合蛋白。

弹性蛋白是弹性纤维的主要成分，弹性纤维主要存在于韧带和脉管壁，与胶原纤维共同存在，赋予组织以弹性和抗张能力。另外，弹性蛋白作为细胞外基质的主要成分，起着一定的细胞间粘附和支持作用。人体皮肤衰老与真性弹性纤维被弹性蛋白酶降解有关。

五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n是类弹性蛋白多肽基本序列单元，其中Xaa称为客座残基，是除了Pro以外的任意一种氨基酸。类弹性蛋白是仿照天然弹性蛋白氨基酸序列特性人工合成的蛋白质，具有良好的细胞相容性、并能够在体内自然降解成氨基酸。另外，弹性蛋白来源于细胞外基质，具有与弹性蛋白相似结构的类弹性蛋白能向细胞组织提供相似的细胞外基质环境。类弹性蛋白具有依赖于自身的序列、盐度、温度敏感性的可逆相变过程。基于ELP的可逆相变特性，使用ELP作为纯化标签纯化蛋白的方法被称为可逆相变循环法(ITC，Inverse Transition Cycling)法，ITC纯化融合蛋白的方法是一种新型、发展潜力大、应用前景广的非色谱纯化技术，而且具有回收率高、操作简单、可对目标蛋白浓缩富集等优势。目前，也还未见有关于人源胶原蛋白和弹性蛋白融合的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种重组类人胶原蛋白(rhLEC)。

本发明的第二个目的在于提供所述重组类人胶原蛋白的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供所述重组类人胶原蛋白的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种重组类人胶原蛋白(rhLEC)，包含五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n和类人胶原蛋白肽(rhCOL，此类人胶原蛋白肽序列与中国专利CN104098701A中SEQ ID NO:1相同)。

本发明通过融合类人胶原蛋白肽和类弹性蛋白多肽各自不同的功能域得到上述rhLEC。所述融合蛋白可在大肠杆菌中进行可溶性表达，并通过逆相变循环法纯化，解决了现有类人胶原蛋白肽蛋白粗提及纯化步骤复杂、蛋白损耗大的问题。同时所述融合蛋白中类弹性蛋白能与水分子形成氢键，还可以与其他蛋白分子形成氢键增加融合蛋白的热稳定性，另外，本发明还意外发现所述rhLEC在促细胞粘附和创伤修复方面具有显著效果。

优选地，所述类人胶原蛋白肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述五肽重复序列Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n中Xaa为异亮氨酸，n＝40～60。