[发明专利]一种多酶复合体及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种TLL‑CvFAP多酶复合体及其构建方法和应用，所述构建方法，包括先构建TLL‑linker‑SpyCatcher重组蛋白工程菌和CvFAP‑linker‑SpyTag重组蛋白工程菌，然后进行表达，得到CvFAP‑linker‑SpyTag蛋白和TLL‑linker‑SpyCatcher蛋白，将上述两种蛋白在胞外混合，进行自组装，得到TLL‑CvFAP多酶复合体。所述的TLL‑CvFAP多酶复合体作为催化剂在油脂生产烷(烯)烃中应用，提高级联反应的催化效率和烷(烯)烃的得率。

技术领域

本发明属于生物酶催化领域，具体涉及一种新的光脱羧酶(CvFAP)-脂肪酶的多酶复合体及其构建方法和应用。

背景技术

石油能源的日益减少和环境的不断恶化加速了可持续发展道路的研究进程。开发利用可再生生物质资源生产生物燃料的技术，以生物燃料替代石油燃料，成为各国相关研究者科学研究的重要任务。在可再生的生物质资源中，以餐饮废油、非食用油等为代表的油脂近年来受到广泛关注。脂肪酸作为油脂水解产物的最主要成分，仅需脱去一个羧基即可形成各类烷(烯)烃，与石油成分近乎完美匹配。因此，利用非食用油及废油经水解生成脂肪酸，进一步经脱羧制备烷(烯)烃，已成为目前相关行业研究的焦点。

通过多酶级联催化油脂水解脱羧制备烷(烯)烃，能克服传统化学法制备能耗高、污染重、专一性差等诸多难题。目前，该级联反应专用酶主要由催化油脂水解的脂肪酶和催化脂肪酸脱羧的脱羧酶构成。一方面，相对于研究时间较长、成熟度较高的脂肪酶，脱羧酶仍处于探索发展阶段；另一方面，多酶级联反应存在酶兼容性差、催化效率低下等问题。因此，寻找高效的新型脱羧酶并探索催化效率高的多酶级联体系是该行业突破瓶颈的关键。近年来开发了诸如P450类脂肪酸脱羧酶、末端烯烃酶(OleT_JE)等多种脱羧酶，但大多数脱羧酶存在催化效率低，需额外添加昂贵的辅因子等缺点。

2017年，Science报道了Fred Beisson等发现的一种来源于微藻的新型光脱羧酶(Chlorella variabilis fatty acid photodecarboxylase，CvFAP)可利用蓝光催化饱和/不饱和脂肪酸转化生成烷(烯)烃，无需添加昂贵辅因子，只需利用蓝光就能将脂肪酸转化为烷(烯)烃，CvFAP代表全新的应用领域。若能够扩大这种反应的规模，所得烃类产物极有可能改变当今能源结构，并大力推进光驱动酶的研究。目前针对该酶的研究主要集中在其催化机理和催化性质，利用油脂进行级联催化的报道还较少。

近年来，受天然多酶复合体的启发，很多研究者尝试构建人工多酶复合体，期望通过在不同酶分子之间搭建底物通道，来提高人工代谢途径和体外多酶催化系统的转化效率。目前有效的多酶组装方法包括载体连接的共固定、蛋白共价交联、蛋白融合、生物大分子骨架连接的多酶组装以及无骨架多酶自组装技术等。其中，无骨架自组装多酶催化体系能有效克服基因融合、蛋白骨架系统等技术在多酶复合体系构建中存在的缺陷，实现多种酶蛋白在二维空间的有序组装。SpyTag/SpyCatcher自反应系统高效稳定的共价偶联特征使其成为一个很有潜力的蛋白组装工具。目前以SpyTag/SpyCatcher为功能模块组装无骨架多酶复合体的研究仍处于起步阶段。

本发明将光脱羧酶和脂肪酶联用，首次利用SpyTag/SpyCatcher自反应系统开发一种体外自组装构建CvFAP-脂肪酶多酶复合体的方法，并将该多酶复合体应用于催化油脂转化制备烷(烯)烃，旨在提高CvFAP-脂肪酶级联催化油脂转化为烷(烯)烃反应的催化效率，为降低生物燃料的合成成本、提高生产效率提供技术支持。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种TLL-linker-SpyCatcher重组蛋白工程菌的构建方法。

实现上述目的的技术方案如下。

一种TLL-linker-SpyCatcher重组蛋白工程菌的构建方法，包括以下步骤：