[发明专利]一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III的方法及其所制备的SUMO_肝素酶III融合蛋白

说明书

本发明公开了利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III的方法及其所制备的肝素酶III，该制备方法包括下列步骤：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶III序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共659aa；去除信号肽序列，获得肝素酶III的DNA序列，如SEQIDNo.2；将所述肝素酶III的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的pSMART载体质粒；将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，通过发酵和纯化获得融合蛋白；用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶III。本发明的优点是：提高目标蛋白质的可溶性、促进目标蛋白质的正确折叠，避免形成包涵体；降低纯化成本、提高纯化效率；SUMO蛋白标签分子量较小，对肝素酶III的酶活性影响较小，获得纯化的肝素酶III。

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及涉及一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III(heparinase III)的方法。

背景技术

肝素酶主要从一些利用肝素为碳源的细菌中分离得到，最初来源于肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)，从肝素黄杆菌中分离纯化出的肝素酶有三种，分别为肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶的主要作用是降解肝素，在酶降解法生产低分子肝素和超低分子肝素中有广泛应用。

目前用于低分子肝素生产的肝素酶产品主要有两种来源：一是直接从产肝素酶的微生物中发酵提取(深圳市海普瑞药业股份有限公司， CN102286448B)；二是通过基因工程技术构建重组肝素酶工程菌，发酵提取重组肝素酶。

直接从产肝素酶的微生物(如肝素黄杆菌等)中提取肝素酶III，发酵条件和纯化工艺相对复杂，通过菌种选育提高产量的潜力有限。

基因工程重组技术已广泛应用于蛋白质制备，目前已有将麦芽糖结合蛋白(MBP)标签与肝素酶III形成融合蛋白等应用。采用基因工程重组技术在大肠杆菌系统中生产肝素酶III等外源蛋白质时面临两个挑战：一是所用蛋白质表达系统的表达水平较低；二是所表达的蛋白质被错误折叠进不溶性的聚集体——包涵体中，提取和复性困难。

目前，采用可溶性蛋白标签与肝素酶III形成融合蛋白，可以显著提高重组产物的溶解性。但是，类似谷胱甘肽巯基转移酶标签(GST-Tag)、麦芽糖结合蛋白标签(MBP-Tag)、转录抗终止因子A标签(NusA-Tag)等融合蛋白标签，因为分子量较大(26-55kDa)，会干扰目标蛋白质的正常功能，并且在表达和后续纯化过程中去除标签等环节相对降低了目标蛋白质的产率。

发明内容

为解决现有技术的缺陷和不足，本发明的目的是提供一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III(heparinase III)的方法，以极大地提高目标蛋白质的稳定性和可溶性，提高目标蛋白质的活性及产率。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

根据本发明的一个方面，提供了一种利用SUMO融合表达系统制备重组肝素酶III(heparinase III)的方法，包括下列步骤：

S01：选择来自肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)的肝素酶III序列，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，共659aa；

S02：去除信号肽序列，获得肝素酶III的DNA序列，如SEQIDNo.2；

S03：将所述肝素酶III的DNA序列插入带有N端SUMO蛋白标签的 pSMART载体质粒；

S04：将正确的质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，经发酵和纯化获得SUMO_肝素酶III融合蛋白；

S05：用SUMO蛋白酶将SUMO标签蛋白从步骤S04所述的SUMO_肝素酶 III融合蛋白上切割下来，即获得肝素酶III。